Quantificazione della resistenza agli antibiotici mediata da Plasmid in un approccio sperimentale all'evoluzione

I plasmidi sono elementi extracromosomiali che sono onnipresenti nella maggior parte delle specie batteriche e degli habitat in cui sono agenti molto importanti del trasferimento genico laterale in quanto possono migrare tra le cellule e tra le popolazioni. Uno degli esempi più sorprendenti e importanti di tale trasferimento è la diffusione di geni di resistenza agli antibiotici codificati sui plasmidi. Per costruire un modello plasmide che codifica un gene di resistenza agli antibiotici, scegli una spina dorsale plasmide e PCR amplifica la spina dorsale utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà e primer che si legano al modello plasmide. Nel nostro caso abbiamo usato una spina dorsale plasmide pBBR1. Successivamente, amplificare il gene di resistenza nptII incluso il promotore nativo Tn5 usando una polimerasi ad alta fedeltà. Progettare i primer per il gene di resistenza con circa 20 coppie di basi di complementarità di sequenza alla spina dorsale plasmide. Dopo i PCR, fondere la regione di omologia del prodotto PCR del gene di resistenza purificata alla spina dorsale plasmide purificata utilizzando l'assemblaggio isotermico a 50 gradi per 60 minuti. Trasforma il prodotto fuso in E.Coli DH5-Alpha usando l'elettroporazione. Piastra 100 microliter della miscela su mezzi selettivi e incubare a 37 gradi per circa 24 ore. Il plasmide può quindi essere estratto, convalidato e trasformato nel ceppo di tipo selvatico E.coli MG1655. Questo produce ceppo MG1655 pCON.Durante l'esposizione agli antibiotici, i batteri hanno bisogno del plasmide per sopravvivere. Pertanto, il plasmide è sotto selezione positiva. In condizioni non selettive, quindi senza antibiotici, il plasmide è usa e getta per la cellula. Lo scopo del nostro studio era quello di seguire i plasmidi in tali condizioni non selettive nel tempo. A questo scopo, abbiamo dotato i piccoli plasmidi di un gene di resistenza agli antibiotici e lo abbiamo introdotto a Escherichia coli. Abbiamo condotto un esperimento evolutivo e monitorato la frequenza dei plasmidi attraverso la placcatura della replica. Il ceppo di trasporto plasmide mg1655 pCON è ora introdotto in un esperimento di evoluzione. In primo luogo, piastra mg1655 pCON su piastre di agar LB integrate con antibiotici e incubare durante la notte a 37 gradi. Da questo piatto scegli casualmente le 8 colonie di antenati e incuba durante la notte a 37 gradi con scuotimenti costanti. Il giorno successivo, le popolazioni vengono trasferite all'esperimento condotto in 96 piastre di pozzi profondi. È molto importante distribuire casualmente le repliche attraverso la piastra. Ad esempio, in un approccio a scacchiera. Nel nostro esperimento le colture vengono diluite e trasferite con diversi tassi di diluizione e a due temperature. Durante ogni evento di trasferimento viene applicato il trattamento di diluizione e il trasferimento seriale viene ripetuto su un totale di 98 trasferimenti. Lungo l'esperimento evolutivo la frequenza dei plasmidi nella popolazione è stimata dalla proporzione di cellule portatrici di plasmidi. La placcatura a replica è stata reso popolare da Esther e Joshua Lederberg negli anni '50, dove l'hanno usata per studiare la resistenza ai farmaci nei batteri. Il metodo consentirà loro di migliorare la loro scansione per i fenotipi e alla fine dello studio ha rivelato che la resistenza alla penicillina può insorgere nei batteri a causa di mutazioni spontanee nel genoma. Per determinare la frequenza plasmide nella popolazione durante l'esperimento, le colture stazionarie vengono diluite in serie e placcate su piastre di agar LB non selettive. Regolare la diluizione in base a una resa da 250 a 500 colonie per piastra. Le popolazioni placcate vengono incubate per una crescita notturna a 37 gradi per meno di 24 ore. Le colonie sono meglio replicate quando sono ancora piccole. Dopo la crescita notturna contano tutte le colonie utilizzando un contatore di colonie automatizzato di scelta del lettore. Questo produce la dimensione totale della popolazione di batteri nelle colture. Si noti che le colonie sul bordo della piastra dovrebbero essere lasciate fuori. Per replicare le piastre, sono necessarie piastre di agar selettive integrate con antibiotici, un blocco rotondo, un anello metallico che si adatta al blocco e un panno di velluto sterile. Il panno deve essere 100% cotone in quanto questo può essere sterilizzato per autoclave. Posizionare il panno sul blocco e fissarlo con l'anello metallico.Posizionare con cura il piatto con le colonie contate sulla superficie fissa del panno di velluto. Toccare la piastra nei movimenti del cerchio in modo che tutta la superficie della piastra tocchi il panno. È molto importante che tutte le colonie tocchino il velluto. Rimuovere la piastra LB e posizionare la piastra selettiva sul velluto. Ripetere l'attenta maschiatura. È ancora una volta importante che il piatto tocchi completamente il velluto. Successivamente, rimuovere la piastra selettiva. Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente durante la notte. Il giorno successivo, sia l'LB che la piastra degli antibiotici sono necessari per la valutazione. Posizionare le piastre una sopra l'altra e confrontare la crescita. Puoi facilmente individuare spazi senza colonie. Queste sono le colonie che non sono resistenti agli antibiotici. Pertanto, queste colonie hanno perso il plasmide. Alla fine, segna quante colonie mancano sulla piastra degli antibiotici. Questo numero ti dà la perdita di plasmide. Ripeti settimanalmente la placcatura replica di tutte le popolazioni durante l'esperimento di evoluzione. La perdita di plasmide può essere causata da multi-malformazione plasmide. Quando si lavora su una costruzione plasmide dire per l'espressione di un dato gene nel ceppo ospite preferito il comportamento nativo di un plasmide in vivo per quanto riguarda la conferma che uno stato può prendere è di solito qualcosa che viene trascurato. Ma in un contesto evolutivo tale conferma dei cambiamenti potrebbe essere di grandissimo importanza. L'analisi delle conferme plasmidiche può essere uno sforzo molto complicato. Soprattutto i multimeri plasmidici sono difficili da analizzare perché non possono essere identificati correttamente dalla PCR o dal sequenziamento. D'altra parte, i multimeri plasmidici sono difficili da analizzare per elettroforesi gel a causa delle loro dimensioni potenzialmente grandi e della loro lenta mobilità elettroforetica. Il nostro protocollo offre un metodo semplice e diretto per lo screening e l'identificazione di multimeri plasmidici in direi qualsiasi preparazione plasmide. Alle molecole plasmidiche visive estrarre il plasmide da 5 mL di coltura cellulare stazionaria durante la notte usando lisi alcalina. L'estrazione plasmide di plasmidi a bassa copia spesso porta alla contaminazione con DNA cromosomico ospite che deve essere digerito prima della visualizzazione. Per rimuovere la contaminazione cromosomica del DNA trattare il DNA plasmide estratto con Plasmid-Safe