Name: Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Impara la mappatura ottica per registrare simultaneamente tensione transmembrana e calcio intracellulare in fette cardiache umane. Questo metodo avanzato consente test farmacologici preclinici accurati su tessuto cardiaco umano vivo.

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I finanziamenti di NIH (sovvenzioni R21 EB023106, R44 HL139248 e R01 HL126802), della fondazione Leducq (progetto RHYTHM) e di una borsa di studio post-dottorato dell'American Heart Association (19POST34370122) sono riconosciuti.

<ol><li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+animal+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li>
<li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+today%27s+translational+medicine+world%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li>
<li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%2C+Medicine%2C+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
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<li>Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic%3F+An+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li>
<li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331(2014).</li>
<li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li>
<li>Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immature+electrophysiological+phenotype+of+iPSC-CMs+still+hampers+in+vitro+drug+screening%3A+Special+focus+on+IK1%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1.</a> Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+and+proliferation+of+mammalian+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes.</a> PloS One. 5 (9), 12559(2010).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168(2019).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, 117(2019).</li>
<li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li>
<li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology+2%22%5BJournal%5D)">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).</li>
<li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices%3A+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798(2016).</li>
<li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li>
<li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Slices%3A+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li>
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<li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275(2011).</li>
<li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-Source+Multiparametric+Optocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721(2019).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li>
<li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109(2018).</li>
<li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli%2C+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration%2C+and+different+steady-state+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li>
<li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, presentiamo metodi passo-passo per ottenere fette cardiache vitali da cuori umani arrestati cardioplegically e per caratterizzare funzionalmente le fette utilizzando la doppia mappatura ottica del potenziale transmembrana e del calcio intracellulare. Con l'ambiente extracellulare preservato e l'accoppiamento nativo delle cellule cellulari, le fette cardiache umane possono essere utilizzate come modello accurato del cuore umano per la scoperta scientifica fondamentale e per i test di efficacia e cardiotossicità di ag...

I modelli animali sono stati un valido strumento utilizzato per comprendere i meccanismi alla base della fisiologia e della fisiopatologia umana, nonché una piattaforma per la sperimentazione preliminare delle terapie per il trattamento di varie malattie1. Sono stati compiuti grandi passi avanti nel campo della ricerca biomedica basata su questi studi sugli animali2. Tuttavia, esistono differenze significative tra le specie tra le fisiologie umane e animali, tra cui topi, ratti, porcellini d'India, conigli, pecore, maiali e cani3,4. Di conseguenza, ci sono state numerose terapie farmacologiche, geniche e cellulari che hanno mostrato promessa durante la fase di sperimentazione animale, ma non sono riuscite a vivere fino ai risultati negli studi clinici5. Per colmare questa lacuna, sono stati sviluppati come modelli per colmare la risposta della fisiologia umana a vari farmaci e malattie a vari farmaci e malattieindottedall'uomo. I cardiomiociti derivati dalle cellule staminali sono stati ampiamente utilizzati nei sistemi organo-su-chip come surrogato del cuore6,7,8. Tuttavia, l'utilità dei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CMs) è ostacolata dal loro fenotipo relativamente immaturo e dalla mancanza di rappresentazione della sottopopolazione cardiomiocita; il miocardio maturo è una struttura complessa composta da diversi tipi di cellule coesistenti come fibroblasti, neuroni, macrofagi e cellule endoteliche. D'altra parte, i cardiomiociti umani isolati sono elettricamente maturi, e diverse sottopopolazioni cardiomiociti possono essere ottenute alterando i parametri di coltura9. Tuttavia, questi miociti mostrano generalmente un'azione alterata potenziali morfologie a causa della mancanza di accoppiamento cellulare, rapida de-differenziazione, e la comparsa di comportamento proaritmico in vitro10,11. Alcune delle limitazioni sono state affrontate da modelli di coltura cellulare 3D di iPSC-CMs e miociti cardiaci. Questi modelli, che includono sferoidi, scaffold idrogel incapsulati colture 3D, tessuti cardiaci ingegnerizzati (EIT) e sistemi cuore su un chip, utilizzano più popolazioni di cellule cardiache come cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali. Si auto-assemblano o assemblano lungo un ponteggio per formare strutture 3D, e alcuni riproducono anche la complessa natura anisotropica del miocardio. Questi modelli sono stati segnalati per avere cellule di fenotipi maturi, proprietà contrattuali, e profili molecolari simili al tessuto cardiaco. Il sistema heart-on-a-chip consente anche lo studio degli effetti sistemici nei modelli di droga e malattia. Tuttavia, i modelli a base di cellule in vitro non hanno la matrice extracellulare nativa e quindi non sono in grado di imitare con precisione l'elettrofisiologia a livello di organo. Le fette cardiache umane, al contrario, hanno una matrice extracellulare intatta e contatti autocellulari a cellule, il che li rende utili per esaminare con maggiore precisione le proprietà aritmogene del miocardio umano.
I ricercatori hanno sviluppato fette di organotipiche cardiache umane come piattaforma preclinica fisiologica per test sui farmaci acuti e cronici e per studiare l'elettrofisiologia cardiaca e la progressione delle malattie cardiache12,13,14,15,16,17,18,19. Rispetto ai cardiomiociti derivati da iPSC, le fette cardiache umane replicano più fedelmente l'elettrofisiologia cardiaca umana adulta con un fenotipo cardiomiocito maturo. Rispetto ai cardiomiociti umani isolati, le fette cardiache presentano durate potenziali di azione fisiologica a causa dell'accoppiamento cellula-cellula ben conservato e dell'esistenza intrinseca dei loro ambienti nativi intra ed extracellulari.
Questo protocollo descrive il processo di generazione di fette cardiache umane da cuori interi donatori, eseguendo studi acuti (cioè di ore) e cronici (cioè giorni lunghi) per testare i parametri di elettrofisiologia cardiaca tramite mappatura ottica. Mentre questo protocollo descrive solo l'uso del tessuto ventricolare sinistro (LV), è stato applicato con successo ad altre regioni del cuore così come altre specie come topi, ratti, porcellini d'India e maiali14,20,2121,22. Il nostro laboratorio utilizza interi cuori donatrici che sono stati respinti per il trapianto negli ultimi 5 anni, ma è possibile che queste stesse procedure vengano eseguite su qualsiasi tessuti campione di cuore donatore ottenuti con mezzi alternativi (ad esempio, impianti di assistenza ventricolare sinistra [LVAD], biopsie, miectomie) purché i tessuti abbiano la capacità di essere sezionati in cubi. La mappatura ottica viene utilizzata per l'analisi in questo studio a causa della sua capacità di mappare simultaneamente potenziali di azione ottica e transitori di calcio con alta risoluzione spaziale (100 x 100 pixel) e temporale (>1,000 fotogrammi/s). È anche possibile utilizzare metodi alternativi, come gli array multielettrodi (MEA) o i microelettrodi, ma queste tecniche sono limitate dalle loro risoluzioni spaziali relativamente basse. Inoltre, i MEA sono stati progettati per l'uso con le colture cellulari e i microelettrodi taglienti sono più facilmente gestiti per l'uso con cuori interi o grandi cunei di tessuto.
L'obiettivo dell'articolo è quello di consentire a più ricercatori di utilizzare tessuti cardiaci umani per studi di elettrofisiologia cardiaca. Va notato che la tecnologia descritta in questo articolo è relativamente semplice e vantaggiosa per gli studi a breve termine (nell'ordine di diverse ore a giorni). Più fisiologica cultura biomimetica per studi a lungo termine (nell'ordine di settimane) è stato discusso e descritto da una serie di altri studi12,18,23. Stimolazione elettrica, carico meccanico e stretching dei tessuti sono meccanismi di condizionamento vantaggiosi che possono aiutare a limitare l'insorgenza del rimodellamento del tessuto in vitro12,18,23.

<table><tbody><tr><td>Siringa BD da 1 ml</td><td>Thomas Scientific</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butandione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di biosicurezza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Cayman</td><td>13186</td><td></td></tr><tr><td>Trappola a bolle</td><td>Radnoti</td><td></td><td></td>130149</tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPS</td> Soluzione madre di <td>biozio</td><td></td><td>a 1,25 mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>DMSO Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3c Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> di emissione <td>Chroma</td><td>T630LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>(RH237)</td><td>Chroma</td><td>ET690/50m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione (Rhod2AM)</td><td>Chroma</td><td>ET590/33m</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico di eccitazione</td><td>Chroma</td><td>T550LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione</td><td>Chroma</td><td>ET500/40x</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Provette da centrifuga coniche</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Scambiatore di calore</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50145502</td><td></td></tr><tr><td>Insulina transferrina selenio (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa di eccitazione a LED</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-Mic-LED-520</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnessio esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>Micam Ultima Telecamera CMOS tipo L</td><td>Scimedia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Pennicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07522-20</td><td></td></tr><tr><td>Filo di stimolazione in platino</td><td>Alfa Aesar</td><td>43275</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P6867</td><td>poliolo tensioattivo non ionico</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Dati Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab acquisizione e stimolatore</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 4/26</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore, perlina secca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z378550</td><td></td></tr><tr><td>Stone Diffusore di ossigeno Waterwood</td><td></td><td>B00O0NUVM0</td><td></td></tr><tr><td>TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive</td><td>gobiomed</td><td>AESCULAP</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td></td> a ultrasuoni <td>Branson 1800</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Campden Instruments</td><td>7000 smz</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

I preparati per fetta cardiaca umana sono stati recentemente sviluppati come piattaforma per gli studi di fisiologia umana e i test terapeutici per colmare il divario tra gli studi sugli animali e quelli clinici. Numerosi modelli animali e cellulari sono stati utilizzati per esaminare gli effetti dei farmaci, ma queste risposte spesso differiscono negli esseri umani. Le fette cardiache umane offrono un vantaggio per i test antidroga in quanto sono direttamente derivate da cuori umani vitali. Oltre ad aver conservato strutture multicellulari, accoppiamento cellulare e ambienti a matrice extracellulare, le fette di tessuto cardiaco umano possono essere utilizzate per testare direttamente l'effetto di innumerevoli farmaci sulla fisiologia cardiaca umana adulta. Ciò che distingue questo modello da altre preparazioni cardiache, come cuori interi o cunei, è che le fette possono essere sottoposte a una cultura a lungo termine. Come tale, fette cardiache consentono di studiare gli effetti acuti e cronici dei farmaci. Inoltre, la capacità di raccogliere diverse centinaia o mille fette da un solo cuore rende questo un modello ad alto throughput per testare diversi farmaci a concentrazioni diverse e combinazioni con altri farmaci allo stesso tempo. Le fette possono essere preparate da qualsiasi regione del cuore. In questo protocollo, descriviamo la preparazione di fette ventricolari a sinistra isolando i cubi di tessuto dalla parete libera ventricolare sinistra e sezionandoli a fette utilizzando un microtoma vibrante di alta precisione. Queste fette possono quindi essere sottoposte a esperimenti acuti per misurare la funzione elettrofisiologica cardiaca di base o coltivate per studi sui farmaci cronici. Questo protocollo descrive anche la doppia mappatura ottica delle fette cardiache per registrazioni simultanee di potenziali transmembrani e dinamiche intracellulari del calcio per determinare gli effetti dei farmaci studiati.

Le fette organotpice umane sono state raccolte dal ventricolo sinistro di un cuore umano del donatore secondo il protocollo descritto sopra e illustrato inFigura 1. Un sistema di mappatura ottica a doppia fotocamera come quello inFigura 2è stato utilizzato nella configurazione di imaging verticale per eseguire la mappatura ottica simultanea di tensione e calcio circa 1 h dopo il completamento del protocollo di taglio. I dati sono stati analizzati utilizzando RHY...

Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l'uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Questo protocollo è significativo perché fornisce ai ricercatori le capacità di impiegare cuori umani donatori per test fisiologici preclinici sui farmaci. Questo tessuto utilizza sia coloranti di tensione che di calcio per la caratterizzazione simultanea di potenziali di azione cardiaca e transitori di calcio intracellulare nelle fette di tessuto umano. Per impostare il sistema di mappatura ottica, attaccare un bagno di tessuto con uno strato di gel polidimetilsiloxano inferiore a un sistema di perfusione e far circolare un litro di soluzione di recupero a 37 gradi Celsius ossigenato con ossigeno al 100% attraverso il sistema di perfusione a una portata abbastanza veloce da mantenere la temperatura e prevenire l'accumulo di perfusato di bagno.Quindi utilizzare un bersaglio per regolare la messa a fuoco e l'allineamento delle due telecamere CMOS e utilizzare una sorgente di luce LED verde con una lunghezza d'onda di 520 più o meno cinque nanometri per eccitare simultaneamente i coloranti sensibili alla tensione e agli indicatori di calcio. Prima di ottenere sezioni tissutali, mescolare la soluzione di cardioplegia congelata e liquida e posizionare il tessuto cardiaco nel bagno card

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Questo articolo descrive una tecnica ad alta risoluzione temporale e spaziale a otticamente movimento immagine del potenziale d'azione sulla superficie del Langendorff-cuore perfuso di ratto utilizzando un colorante potenziometrica (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Questo articolo descrive le procedure di base per lo svolgimento di esperimenti di mappatura ottica nella Langendorff-perfuso cuore di coniglio con il sistema di imaging panoramico, e il doppio (tensione e calcio) modalità di imaging.

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

In questo documento i dettagli della procedura di dissezione, la configurazione strumentale, e delle condizioni sperimentali durante la mappatura ottica del potenziale transmembrana (Vm) e calcio intracellulare transitoria (CAT) in intatti Langendorff isolato perfuso cuori mouse.

Mappatura ottico dei potenziali d&#39;azione e transitori Calcio nel Cuore mouse

Questo articolo descrive la tecnica utilizzata per eseguire la mappatura ottica a doppio canale in monostrati di cellule atriali HL-1 in coltura. Questo protocollo unico consente la visualizzazione simultanea dell'attività del calcio (Ca) e del voltaggio (Vm) nella stessa area per il rilevamento e l'analisi dettagliati delle proprietà elettrofisiologiche dei monostrati di coltura.

Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato

Questo articolo viene descritto il protocollo dettagliato e le attrezzature necessarie per la mappatura ottica doppio di transmembrana potenziale (V m) e senza reticolo intra-sarcoplasmatico (SR) Ca 2+ nel cuore di coniglio Langendorff-perfusione. Questo metodo consente l'osservazione diretta e la quantificazione delle Vm e SR Ca 2+ dinamica nel cuore intatto.

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii murini che utilizza un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale, tra cui registrazioni duale della tensione della membrana e Ca2 + transitoria sotto programmato stimolazione tramite un catetere elettrodo specializzato.

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione del sistema nervoso autonomo intracardiaco e la valutazione della sua influenza su base elettrofisiologia, aritmogenesi e accampamento dinamica utilizzando un'installazione di Langendorff ex vivo .

Impatto dei neuroni intracardiaci elettrofisiologia cardiaca e aritmogenesi in un sistema di Langendorff Ex Vivo

L'obiettivo di questo studio era quello di stabilire un metodo per studiare le dinamiche cardiache utilizzando un modello animale traslazionale. L'approccio sperimentale descritto incorpora l'optocardiografia a doppia emissione in combinazione con uno studio elettrofisiologico per valutare l'attività elettrica in un modello cardiaco porcina isolato e intatto.

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

Presentiamo un protocollo per valutare gli effetti elettromeccanici dell'attivazione di GtACR1 nei cardiomiociti del coniglio. Forniamo informazioni dettagliate sull'isolamento cellulare, la coltura e la trasduzione adenovirale, e sugli esperimenti funzionali con le tecniche patch-clamp e fibra di carbonio.

Valutazione elettromeccanica dell'attività cardiomiocite ottogeneticamente modulata

Questo protocollo introduce la mappatura ottica a doppio colorante di cuori di topo ottenuti da animali wild-type e knock-in affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica, comprese le misurazioni elettrofisiologiche del voltaggio transmembrana e dei transitori intracellulari di Ca2+ con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

Impara la mappatura ottica per registrare simultaneamente tensione transmembrana e calcio intracellulare in fette cardiache umane. Questo metodo avanzato consente test farmacologici preclinici accurati su tessuto cardiaco umano vivo.

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Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

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