Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

I geni morfogenici delle piante possono essere utilizzati per migliorare la trasformazione genetica dei genotipi recalcitranti. Descritto qui è un protocollo di trasformazione genetica mediata agrobatterica(QuickCorn) per tre importanti linee pubbliche di mais.

La maggior parte delle linee di mais inbred non può essere trasformata geneticamente utilizzando protocolli di trasformazione convenzionali. Qui viene descritto un metodo di trasformazione QuickCorn che è veloce e meno dipendente dal genotipo. Il metodo QuickCorn utilizza i fattori di trascrizione del mais BABY BOOM e WUSCHEL.

Quando incorporati nel sistema vettoriale di trasformazione, questi geni lavorano sinergiticamente per stimolare la crescita embriogenica. A differenza dei protocolli convenzionali di trasformazione del mais, il metodo QuickCorn non comporta una fase di induzione del callo durante la trasformazione. La regione T-DNA del vettore binario utilizzato nel nostro lavoro contiene tre componenti chiave, geni morfogenici, geni marcatori e il sistema di ricombinazione cre/loxP.

Il sistema di ricombinazione cre/loxP indotto dal calore è stato incluso nel T-DNA per rimuovere i geni morfogenici dal genoma del mais per consentire la normale rigenerazione del callo nello sviluppo delle piante. Circa due o tre giorni dopo l'emergere delle sete e se il polline sarà disponibile il giorno seguente, tagliare le sete e la buccia con forbici sterilizzate con etanolo al 70%, circa 2 1/2 centimetri sotto l'estremità delle foglie della buccia, dove emergono le sete, e coprire la seta con un sacchetto di germogli. Una volta che le anthers emergono da una nappa, coprire la nappa con un sacchetto di nappa e posizionare una graffetta non skid alla base del sacchetto intorno al gambo.

La mattina dopo aver posizionato il sacchetto della nappa, piegare delicatamente la pianta e toccare il sacchetto per incoraggiare il rilascio di polline. Quindi rimuovere il sacchetto di nappa e piegare la parte superiore della borsa per evitare che il polline fuorievi. Per impollinare una pianta ricevente, esporre le sete e versare rapidamente il polline dal sacchetto di nappa sulle sete.

Coprire immediatamente l'orecchio impollinato con il sacchetto di nappa e fissare la base del sacchetto intorno al gambo con graffette. Per controllare la dimensione dell'embrione immaturo, da nove a 12 giorni dopo l'impollinazione, tirare delicatamente giù la buccia per esporre i chicchi a circa 1/3 a 1/4 della circonferenza dell'orecchio e circa 1/3 della distanza lungo l'orecchio. Usa un bisturi per tagliare il tappo di un singolo kernel che appare simile alla maggior parte degli altri chicchi per dimensioni e colore, e usa una spatola con un righello per estrarre l'embrione.

Quindi utilizzare il righello o una pinza per misurare la lunghezza dell'embrione. Entro uno o quattro giorni dalla raccolta, rimuovere le bucce e le sete dalle orecchie raccolte e inserire un manico appropriato nella parte superiore o nella base di ogni orecchio. Immergere le orecchie in un grande contenitore di soluzione di candeggina di disinfezione in un cappuccio a flusso laminare sterile con la maniglia rivolta verso l'alto.

Dopo 20 minuti, sciacquare le orecchie tre volte con un generoso volume di acqua distillata sterile fresca per cinque minuti per lavaggio prima di lasciare asciugare le orecchie per diversi minuti. Quindi, riempire un tubo di microcentrifugo a due millilitri per orecchio con mezzo liquido 700A e utilizzare un bisturi sterile per rimuovere da uno a due millimetri superiore di ogni corona del nocciolo per esporre l'endosperma dell'orecchio. Individuare l'embrione immaturo all'interno del nocciolo sul lato rivolto verso la punta dell'orecchio, vicino all'attacco alla sfera.

Per gli operatori top handler e destrorso, appoggia l'orecchio su una grande piastra di Petri sterile e inserisci una micro spatola nell'endosperma nel pericarpo più lontano dall'embrione. Torcere delicatamente verso l'alto per rimuovere l'endosperma e esporre l'embrione e utilizzare la spatola per posizionare con cura l'embrione in un tubo di mezzo liquido 700A. Per gli operatori del conduttore di base che tengono l'orecchio con la mano sinistra, inserire una micro spatola nell'endosperma nel pericarpo più lontano dall'embrione e torcere delicatamente verso l'alto per spostare l'endosperma.

Per coltura degli embrioni in una coltura di sospensione agrobatterio, raccogliere batteri da una piastra di lavoro preparata al momento in 10 millilitri di mezzo liquido 700A e vortice per sospendere completamente la coltura batterica. Misurare la densità ottica ad una lunghezza d'onda di 550 nanometri e lavare gli embrioni con un millilitro di mezzo fresco 700A. Immergere gli embrioni in un millilitro di sospensione Agrobacterium e vortice su un ambiente basso per 30 secondi.

Depositare gli embrioni sul banco con i tubi in orientamento orizzontale per cinque minuti prima di trasferire l'intero contenuto di ogni tubo su singole piastre di mezzo di co-coltivazione da 562V. Ruotare delicatamente le piastre per distribuire gli embrioni in modo uniforme e aspirare la sospensione agrobatterio in eccesso. Orientare attentamente gli embrioni con il lato a forma di cupola rivolto verso l'alto, facendo attenzione a evitare di danneggiare gli embrioni.

Quindi posizionare le piastre in scatole di plastica per un'incubazione notturna a 21 gradi Celsius al buio. La mattina dopo, trasferire accuratamente embrioni infetti su mezzo di riposo 605T, posizionare circa 30 embrioni per piastra, lato scutello verso l'alto, per un'incubazione da quattro a 10 giorni a 26 gradi Celsius al buio. A circa sette giorni, lo sviluppo somatico dell'embrione può essere osservato sulla superficie dello scutello zigotico.

Alla fine del periodo di riposo, posizionare la scatola degli embrioni in un incubatore Celsius di 45 gradi con umidità relativa del 70% per due ore, seguita da un'incubazione da una a due ore a 26 gradi Celsius al buio. Alla fine dell'incubazione, posizionare da 10 a 15 embrioni immaturi scioccati dal calore su singole piastre di mezzo di formazione del germoglio integrate con 05 milligrammi per litro dell'erbicida imazapyr come agente selettivo. Rimuovere con cura eventuali coleoptile in base alle esigenze e riportare gli embrioni all'incubatore scuro Celsius di 26 gradi per due settimane.

Alla fine dell'incubazione, trasferire circa otto pezzi di tessuto per piastra su piastre medie di radicamento per un'incubazione da una a due settimane con 16 ore di luce e otto ore di buio a 27 gradi Celsius. Man mano che le plantle si sviluppano, posiziona una plantlet più forte contenente sia germogli che radici vigorose su singole piastre di mezzo radicante sotto la luce per altri sette-14 giorni. Lasciare che i germogli che non sono completamente sviluppati siano incubati sullo stesso mezzo per un'altra o due settimane fino a quando non sono pronti per essere spostati nel terreno.

Man mano che la pianta diventa più vigorosa, sciacquare le radici con acqua del rubinetto per rimuovere l'agar. Quindi trapiantare le singole piante in vasi da tre pollici contenenti un substrato senza suolo pre-bagnato in un vassoio con fori di scarico e posizionare il vassoio in una camera di crescita con o senza cupola di umidità plastica. Da nove a 14 giorni dopo il trasferimento in vaso, trapiantare ogni plantlet con il terreno in una pentola da 1,5 galloni.

Aggiungere un fertilizzante a rilascio controllato alla pentola e mantenere le piante nella serra. Quando i germogli auricolari iniziano a emergere dalla pianta, usa una borsa da sparo semitrasparente per coprire i germogli in modo che le sete emergenti possano essere osservate senza rimuovere la borsa. Quindi impollinare le piante nella fase appropriata di sviluppo come dimostrato.

Le orecchie di mais vengono generalmente raccolte da nove a 12 giorni dopo l'impollinazione. Embrioni immaturi con lunghezze che vanno da 1,5 a due millimetri sono i migliori espianto per la trasformazione per questo protocollo. Otto giorni dopo l'infezione, gli embrioni somatici che esprimono ZsGreen possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza.

Il trattamento termico otto giorni dopo l'infezione induce l'espressione della cre ricombinasi, con conseguente escissione delle cassette di espressione del gene morfogenico, cre e ZsGreen affiancate tra i due siti loxP. Dopo tre o quattro settimane di coltura su un mezzo di formazione di germogli contenente erbicida, si possono osservare tessuti proliferi con embrioni maturi o gemme di germogli resistenti all'erbicida. Alcuni dei tessuti resistenti agli erbicidi possono essere negativi per ZsGreen, suggerendo che l'escissione cre-mediata si sia probabilmente verificata in questi tessuti.

Dopo aver trasferito i tessuti al mezzo di radicamento e all'incubazione leggera, è possibile raccogliere germogli sani, vigorosi e in crescita con radici ben sviluppate. Si noti che alcuni tessuti possono sembrare avere più germogli probabilmente a causa di piante clonali con schemi di integrazione transgene identici. Il metodo QuickCorn può migliorare notevolmente l'efficienza di trasformazione del mais ed espandere l'elenco dei genotipi trasformabili.

Il protocollo può essere riprodotto con successo dai ricercatori con una formazione minima sulla trasformazione del mais. Utilizzando il metodo QuickCorn, le piante radicate dovrebbero essere pronte per il trasferimento al suolo in sole cinque o sette settimane dopo il giorno dell'infezione. Prestare attenzione alla composizione media, alla tempistica delle sottoculture e alle condizioni di temperatura e illuminazione.

La qualità delle materie prime è essenziale anche per una trasformazione di successo. Le sostanze chimiche, la soluzione di candeggina e l'erbicida utilizzati in questo protocollo sono pericolosi per il rischio biologico. Si prega di assicurarsi di indossare l'attrezzatura di protezione personale appropriata durante il loro utilizzo.