Name: Indurre radici pelose di Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri l'induzione di radici pelose in grano saraceno tartarico mediante trasformazione con Agrobacterium rhizogenes. Questo metodo semplice e economico facilita studi genomici e metabolici nelle piante dicotiledoni.

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Questo lavoro è stato sostenuto dai Fondi fondamentali di ricerca per gli istituti centrali di ricerca sul welfare pubblico, XKT17002.

La TB utilizzata in questo studio è stata chiamata BT18, che ha avuto origine dalla razza di "JinQiao No.2" coltivata dal Centro di ricerca di piccolo grano varie della Shanxi Academy of Agricultural Science. I passaggi principali di questo protocollo sono illustrati nella Figura 1.
NOTA: Utilizzare rapidamente la manipolazione relativa agli espianti e, quando possibile, tenere i piatti Petri chiusi per evitare appassimento e contaminazione. Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni di espiantazioni sono state condotte sotto la condizione di una luce di 14 ore e di un fotoperiodo scuro di 10-h a 25 gradi centigradi. Se non diversamente specificato, tutte le operazioni relative agli espiatori o ai batteri sono state eseguite in condizioni asettiche in una cappa a flusso laminare. Tutti gli ingredienti dei media per A. rhizogenes e colture vegetali in vitro sono forniti nella tabella 1. Dopo aver regolato il pH, tutti i supporti sono stati autoclaventi a 120 gradi centigradi per 20 min.
AVVISO: Depositare tutti i batteri e le piante geneticamente modificati nel contenitore dei rifiuti appropriato. Azionare tutte le sostanze chimiche pericolose in un armadio dei fumi e depositarle nel contenitore dei rifiuti pericolosi.
1. Preparazione di espianti TB
<ol><li>Preparazione di semi di TB<ol>
<li>Selezionare i semi di TB paffuti e non danneggiati (Figura 1A1) che sono stati conservati ad una temperatura inferiore a 20 gradi centigradi per non più di 2 anni.</li>
		<li>Immergere i semi in acqua a 28 gradi centigradi per circa 20 min in modo che il mantello del seme possa essere facilmente staccato (Figura 1A2). Se necessario, utilizzare le forbici per tagliare una fessura sui semi per facilitare il peeling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sterilizzazione dei semi di TB<ol>
<li>Mettere 100-200 semi sbucciati in un fiascheta conico sterilizzato da 100 mL.</li>
		<li>Disinfettare i semi utilizzando 75% etanolo per 30 s.</li>
		<li>Sostituire l'etanolo con 5% di ipocloreto e disinfettare per 15 min. NOTA: La disinfezione con bicloruro di mercurio ad una concentrazione di 1 g/L per 8 min può essere utilizzata come sterilizzatore alternativo per sostituire l'ipoclorito di sodio in caso di sterilizzazione inadeguata. AVVISO: il bicloruro di mercurio è pericoloso e non è un materiale rispettoso dell'ambiente. Azionarlo nell'armadio fumante e depositarlo nel contenitore dei rifiuti pericolosi, se in ogni caso viene utilizzato il bicloruro di mercurio.</li>
		<li>Versare l'ipoclorite di sodio.</li>
		<li>Lavare i semi con acqua sterile deionizzata 5 volte.</li>
		<li>Asciugare i semi con una carta bibulosa sterile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione delle piantine della TB<ol>
<li>Preparare 50 mL Murashige e Skoog (MS) basale medium (1962) integrato con 30 g/L di saccarosio e 7 g/L di polvere di agar (MSSA) (Tabella 1) in una bottiglia di coltura di tessuto vegetale da 300 mL.</li>
		<li>Regolare il pH a 5.8 prima di autoclaving.</li>
		<li>Distribuire 10 semi in modo uniforme per bottiglia di mezzo MSSA.</li>
		<li>Germinai i semi in una sala di coltura a 25 gradi centigradi e 1oC alle condizioni di luce per 7-10 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di espianti sterili<ol>
<li>Selezionare piantine robuste di TB (Figura 1C), quando i 2 pezzi di cotiledoni sono spiegati.</li>
		<li>Tagliare le piantine dalle radici (Figura 1Cfrecce tratteggiate rosse), evitando il contatto con il mezzo.</li>
		<li>Mettetele in una sterile piastra Petri.</li>
		<li>Tagliare gli ipocotilli in segmenti di 0,8-1 cm e tagliare i cotiledoni in pezzi di circa 0,5 cm.</li>
		<li>Precoltura questi esplants su MSSA media sotto la condizione di luce per 24 h.</li>
		<li>Trasferirli in un flacone conico sterilizzato da 100 mL, che ora sono pronti per l'infezione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione di A. rhizogenes per la trasformazione
NOTA: Il ceppo A. rhizogenes ACCC10060 è stato gentilmente fornito dall'Istituto di sviluppo vegetale medicinale e conservato a 80 gradi centigradi. A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario pK7GWIWG2D (II) che ospita un DNA T che trasporta il gene b4 che accompagna un GFP come gene indicatore e il gene di resistenza Kan come marcatore selezionabile. Il gene b4 è un membro della famiglia bHLH del fattore di trascrizione, che non è ancora stata pubblicata. Per valutare il potenziale delle radici pelose della TB, A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario pK7WG2D contenente il gene MYB116 per studiarne l'effetto sulla produzione di metaboliti secondari come i flavonoidi a livello di espressione genica e mediante analisi metaboliche. Attivati A. rizogeni devono essere ben preparati allo stesso tempo con gli espianti.
<ol><li>Attivazione di A. rizogeni
	<ol>
<li>Scongelo A. rhizogenes sul ghiaccio</li>
		<li>Immergere i batteri e allinearli uniformemente su lievito mannitolo medio (YEB) integrato con 15 g/L polvere di agar, 50 mg/L rifampicina, e 50 mg/L spettronomina (YEBARS, pH 7.0).</li>
		<li>Incubare i batteri a 28 gradi centigradi per 12-16 h.</li>
		<li>Scegli una colonia monoclonale e coltiva in un altro piatto Petri nello stesso modo sopra descritto.</li>
		<li>Selezionare colonie monoclonali e colture in un fiaschetta conica sterilizzata 100 mL contenente 20 mL di YEB medio integrato con 50 mg/L rifampicina e 50 mg/L spettronomina (YEBRS, pH 7.0) a 28 gradi C e 200 rpm per 16-18 h fino a quando i valori OD600 raggiunge 2,0.</li>
		<li>Incubare il 2%-4% della coltura di cui sopra in un altro flacone conico da 100 mL contenente 20 mL di yEBRS medio a 28 e 200 rpm per 4-5 h fino a quando il valore di OD600 non raggiunge circa 0,5 (Figura 1D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Infezione e screening degli esoti della TB
NOTA: L'obiettivo di questo protocollo è quello di ottenere radici pelose geneticamente trasformate. Le radici di tipo selvaggio sono state usate come controllo negativo per valutare l'espressione transgenica. In questo protocollo, A. rhizogenes è stato trasformato con il vettore binario o pK7WG2D che trasporta il gene di FtMYB116 o pK7GWIWG2D (II) portando il gene di b4 in anticipo.
<ol><li>Sospensione di A. rhizogenes
	<ol>
<li>Trasferire la coltura ottenuta al punto 2.1.6 in un tubo centrifugo sterilizzato da 50 mL.</li>
		<li>Girare a 4.000 x g per 10 min a 20 gradi centigradi.</li>
		<li>Togliere il supernatante e risospendere il pellet batterico con mezzo MS integrato con 30 g di saccrosio e 300 acetosyringone (AS) (MSSAS, pH 5,8) a OD600 x 0,2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infezione degli espianti<ol>
<li>Infondere la sospensione batterica ottenuta nel passaggio 3.1.3 in un flacone conico contenente gli espianti preparati nel passaggio 1.4.6 per 10 min (Figura 1E).</li>
		<li>Togliere gli espianti e asciugarli con una carta bibulosa sterile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cocultura di espiante con A. rhizogenes
<ol><li>Posizionare una carta filtrante sterile di 9 cm di diametro sul mezzo MS, che viene solidificata utilizzando polvere di agar 7 g/L integrata con 30 g/L di saccarosio e 100 - M AS (medium MSSAAS, pH 5.2).</li>
	<li>Sovrapporre gli espianti sulla carta da filtro a 25 gradi centigradi per 3 giorni al buio (Figura 1F).</li>
</ol>5. Induzione e cultura selettiva
<ol><li>Posizionare circa 20 espianti infetti sul mezzo MSSA integrati con 500 mg/L cefotaxime e 50 mg/L kanamycin (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Figura 1G).</li>
	<li>Incubarli verticalmente a 25 gradi centigradi e 1 gradi centigradi. Le radici pelose si verificano circa 1 settimana dopo l'incubazione(Figura 1H punta di freccia black-dash indicano presenza di radici pelose). NOTA: Se necessario, sostituire il supporto MSSACK ogni 15 giorni.</li>
</ol>6. Subculturing TB radici pelose
NOTA: Questa procedura mira a raccogliere le radici pelose vigorose. Osservare regolarmente la crescita delle radici pelose durante la propagazione e rimuovere quelle contaminate e inattivate in modo tempestivo. Se necessario, ripetere i passaggi seguenti per propagare più radici pelose. Ci vogliono circa 10-14 giorni dalla subcultura alla raccolta.
<ol><li>Selezionare le radici pelose mostrando l'aspetto bianco e la rapida crescita.</li>
	<li>Tagliarli a pezzi di 2-3 cm.</li>
	<li>Chiaramente numerati su una panchina pulita.</li>
	<li>Sottocolturali in un pasciolo conico sterilizzato da 100 mL contenente 5 mL di mezzo MS integrati con 30 g/L di saccarosio e 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) ad una velocità rotativa di 80 giri a 25 gradi centigradi al buio fino a quando non si diffondono sul fondo del pallone (Figura 1I).</li>
</ol>7. Identificazione delle radici pelose trasformate e conservazione
NOTA: Le radici pelose trasformate possono essere identificate in base agli aspetti della morfologia e del livello genico. L'identificazione può anche essere condotta in base al genoma della radice pelosa e alla resistenza, che non sono coperti in questo protocollo. Questa procedura si concentra principalmente sull'identificazione genica e del gene bersaglio dei reporter.
<ol><li>Rimuovere le radici pelose e contaminate e selezionare quelle con aspetto bianco.</li>
	<li>Valutare se c'è fluorescenza verde sotto un transilluminatore ultravioletto doppio blu/leggero.</li>
	<li>Selezionare le radici pelose che presentano un forte segnale di fluorescenza nei tubi numerati o avvolte con una tinfoil marcata dopo averle asciugate con una carta assorbente.</li>
	<li>Liofiloli in azoto liquido, seguito dalla conservazione di tutto il raccolto a 80 gradi centigradi per ulteriori indagini.</li>
	<li>Identificazione genica<ol>
<li>Triturare 0,1 g di radici pelose in polvere fine in azoto liquido.</li>
		<li>Preparare il DNA genomico delle linee transgeniche indipendenti della TB utilizzando il metodo modificato del bromuro di cetyltrimethylammonium (CTAB)25 secondo l'istruzione del produttore del kit di DNA genomico vegetale.</li>
		<li>Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando 100 ng di modello di DNA genomico e primer elencati nella tabella 2.</li>
		<li>Eseguire il ciclo di amplificazione come segue: prenaturazione a 94 gradi centigradi per 5 min, denaturazione a 94 gradi centigradi per 30 s, primer annealing a 55 gradi centigradi per 30 s e estensione primer a 72 s per 30 s. Dopo 36 cicli e un passo di estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 min, analizzare i prodotti di amplificazione su gel agarose 1%.</li>
		<li>Macchiare i gel con colorazione dell'acido nucleico e visualizzarli sotto la luce UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

La TB è stata utilizzata in diversi studi relativi ai metaboliti secondari a livelli genetici e metabolici1,2,5,27,28. La coltura delle radici hairy, come fonte unica per la produzione di metaboliti, svolge un ruolo fondamentale nell'ingegneria metabolica29 e può essere utilizzata per alterare le vie metaboliche inserendo i geni correla...

Il grano saraceno tartario (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) è un tipo di dicoledone appartenente al genere Fagopyrum e alla famiglia Polygonaceae1. Come tipo di cibo omologato medicina levato, la TB ha ricevuto un notevole interesse a causa della sua composizione chimica distintiva e delle diverse bioattività contro le malattie. La tubercolosi è principalmente ricca di carboidrati, proteine, vitamine e carotenoidi, nonché in polifenoli come fenolici e flavonoidi1. Varie attività biologiche e farmacologiche dei flavonoidi, tra cui antiossidanti, antiipertensive2e anti-infiammatori e proprietà antitumorali e antidiabetici, sono state dimostrate3.
Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo che contribuisce allo sviluppo di malattie delle radici pelose in diverse piante superiori, in particolare dicotiledoni, infettando i siti delle ferite4,5. Questo processo è iniziato dal trasferimento del DNA T nel plasmide che induce la radice (Ri)5,6 ed è comunemente accompagnato dall'integrazione e dall'espressione di un gene esogeno dal Ri plasmide e dalle successive fasi di generazione del fenotipo della radice pelosa7. A. le radici pelose transgeniche mediate da rizogeni,come potente strumento nel campo della biotecnologia vegetale, sono state ampiamente utilizzate a causa della loro produttività stabile e elevata e del facile ottenimento in un breve periodo. Inoltre, le radici pelose indotte da A. rhizogenes si distinguono in modo efficiente per il loro sviluppo di radici plagiotropiche e la crescita altamente ramificata in un mezzo privo di ormoni8. Possono essere utilizzati in diversi campi di ricerca, tra cui la produzione di semi artificiali, la ricerca sul nodulo delle radici, e nello studio delle interazioni con altri organismi come i funghi micorrizaci, i nematodi e i patogeni delle radici7,9. Inoltre, le colture di trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente utilizzate come sistema sperimentale per studiare i percorsi biochimici e la segnalazione chimica e per produrre metaboliti secondari vegetali che vengono utilizzati come prodotti farmaceutici, cosmetici e additivi alimentari8,10. I preziosi metaboliti secondari, tra cui alcaloidi indole, aconiti, alcaloidi del tropane, terpenoidi e flavonoidi, sintetizzati in radici pelose di tipo selvatico sono stati studiati per diversi decenni in numerose specie, come il ginsenoside,in Panax ginseng11, coumarine in Ammi majus12, e i composti fenolici in23.13
Le radici pelose sono state prodotte utilizzando A. rhizogenes in 79 specie vegetali di 27 famiglie14. Per esempio, A. rizogenes-mediato trasformazione della radice pelosa mediata è stato segnalato nella soia15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e cicoria (Cichorium intybus L.) 20. Tb trasformazione della radice pelosa è stato studiato anche2. Sono disponibili pochi protocolli dettagliati per quanto riguarda lo sviluppo di radici pelose mediate da A. rhizogenes che trasportano o meno un vettore binario. Per esempio, Sandra et al.21 ha introdotto un metodo per produrre radici pelose di patate transgeniche sostenute nei germogli di tipo selvatico. Le radici pelose completamente sviluppate potrebbero essere visualizzate 5-6 settimane dopo l'iniezione di A. rizogeni che trasportavano il gene del gus reporter negli internodi delle piante di patate. Un altro studio aveva anche riportato un sistema di radici pelose transgeniche indotto da A. rhizogenes che ospita il gene di reporter gusA in iuta (Corchorus capsularis L.) 22. Inoltre, Supaart et al.23 ha ottenuto radici pelose di tabacco transgenico utilizzando A. rhizogenes trasformati con il vettore di espressione pBI121 portando il gene di sintetizzatori di acido1-tetraidrocancandeinolicosco (THCA) per produrre THCA.
Tuttavia, un processo passo-passo per una generazione efficace di trasformazione della radice pelosa, soprattutto nella TB, è stato relativamente meno dimostrato. In questo studio, abbiamo descritto un protocollo dettagliato utilizzando A. rhizogenes che trasporta il gene reporter (GFP), un marcatore selettivo (Kan) e un gene di interesse (b4, un gene identificato dal nostro gruppo ma inedito dalla famiglia di base elicoidale-loop-elica(bHLH) per generare la trasformazione genetica della radice pelosa nella TB. L'esperimento durò 5-6 settimane, dall'inoculazione dei semi alla generazione di radici pelose, coinvolgendo la preparazione dell'espianto, l'infezione, la cocultura, la subcultura e la successiva propagazione. Inoltre, A. rhizogenes contenente un plasmid binario che trasporta la transgene TB del fattore di trascrizione della mieloblastosi 116 (FtMYB116) è stato utilizzato per determinare se il FtMYB116 può promuovere l'accumulo di flavonoidi, in particolare rutina, nella TB a livello genico e metabolico attraverso la trasformazione della radice pelosa della TB. FtMYB116, che è un fattore trascrizionale indotta dalla luce, regola la sintesi della rutina in diverse condizioni di luce5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-idxylase (F3H), flavonoide-3'-hydroxylase (F3'H), e flavonol synthase (FLS)24 sono enzimi chiave coinvolti nel percorso metabolico della biosintesi della rutina. Pertanto, questo studio dimostra la sovraespressione di FtMYB116 nelle radici pelose della TB e l'espressione dei geni enzimatici chiave, nonché il contenuto di rutina e altri flavonoidi come la quercetina.

<table><tbody><tr><td>2 * Taq PCR MasterMix</td><td>Aidlab, Cina</td><td>PC0901</td><td></td></tr><tr><td>Agar polvere</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>A8190</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 termociclatore</td><td>ThermoFisher Scientific, US</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>AS</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>A8110</td><td>Diluito in DMSO, 100 mM</td></tr><tr><td>vettori binari</td><td>ThermoFisher Scientifico (invitrogeno), US</td><td>/</td><td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td></tr><tr><td>Cefotaxima, sodio</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>C8240</td><td>diluito in acqua, 200 mg/mL</td></tr><tr><td>CF15RXII micro ad alta velocità</td><td>Hitachi, Giappone</td><td>No. 90560201</td><td></td></tr><tr><td>Fabbrica di strumenti medici Guanghua</td> <td>con piastra di Petri monouso</td>, Yangzhou, Cina<td>/</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio</td> <td>per elettroforesi DYY-6CBjliuyi, Pechino Cina</td><td>ECS002301</td><td></td></tr><tr><td>Kit di RNA vegetale EASYspin Plus</td><td>Aidlab, Cina</td><td>RN38</td><td></td></tr><tr><td>ELGA purelab untra bioscience</td><td>ELGA LabWater, Regno Unito</td><td>82665JK1819</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per micropiastre Epoch</td><td>biotek, enzima di</td><td></td> reazione BP/LR USA/<td></td></tr><tr><td>Gateway</td><td>ThermoFisher Scientific (invitrogen),</td><td>11789100/11791110</td><td></td></tr> USA<tr><td>Agitatore multifunzionale HYG-C</td><td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. Cina</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kan</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>K8020</td><td>Diluito in acqua, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>MLS-3750 Sterilizzatore per autoclave</td><td>Sanyo, Giappone</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MS sali con vitamine</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio Life Scienza, Pechino, Cina</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>Altri prodotti chimici non dichiarati</td><td>Beijing Chemical Works, Cina</td><td></td><td>etanolo, bicloruro di mercurio, ecc.</td></tr><tr><td>PHS-3C Misuratore di pH</td><td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Cina</td><td>a008</td><td></td></tr><tr><td>Kit DNA genomico vegetale</td><td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td><td>DP305</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>R8010</td><td>Diluito in DMSO, 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>S8040</td><td>Diluito in acqua, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>S8270</td><td></td></tr><tr><td>Trans2K DNA Marker</td><td>TransGen Biotech, Pechino, Cina</td><td>BM101-01</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman diametro 9 cm Carta da filtro</td><td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito in polvere</td><td>Solarbio Life Science, Pechino, Cina</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

indurre radici pelose di agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Il grano saraceno tartario (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possiede varie attività biologiche e farmacologiche perché contiene abbondanti metaboliti secondari come i flavonoidi, in particolare la rutina. Agrobacterium rhizogenes sono stati gradualmente utilizzati in tutto il mondo per indurre le radici pelose nelle piante medicinali per studiare le funzioni geniche e aumentare la resa dei metaboliti secondari. In questo studio, abbiamo descritto un metodo dettagliato per generare A. rhizogenes-mediato radici pelose nella TB. I cotiledonti e l'asse ipocotiledonario a 7-10 giorni furono selezionati come espianti e infettati da A. rhizogenes con un vettore binario, che indusse radici pelose avventurose che apparivano dopo 1 settimana. La trasformazione della radice pelosa generata è stata identificata sulla base della morfologia, della selezione della resistenza (kanamycin) e dell'espressione genica del reporter (proteina fluorescente verde). Successivamente, le radici pelose trasformate si sono propagate come richiesto. Nel frattempo, un fattore di trascrizione della mieloblastosi (MYB), FtMYB116, è stato trasformato nel genoma della TB utilizzando le radici pelose mediate da A. rhizogenesper verificare il ruolo del FtMYB116 nel sintetizzare i flavonoidi. I risultati hanno mostrato che l'espressione dei geni correlati ai flavonoidi e la resa di composti pelosi (rutina e quercetina) sono stati significativamente (p < 0,01) promossi da FtMYB116, indicando che le radici pelose mediate da A. rhizogenespossono essere utilizzate come strumento alternativo efficace per studiare le funzioni genetiche e la produzione di metaboliti secondari. Il protocollo dettagliato passo-passo descritto in questo studio per la generazione di radici pelose può essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica o altre piante medicinali dopo l'adattamento.

Agrobacterium rhizogenes-mediato TB trasformazione della radice pelosa Questo studio descrive il protocollo passo-passo che è stato stabilito per ottenere radici pelose geneticamente trasformate utilizzando A. rhizogenes. Ci sono volute circa 5-6 settimane dall'inoculazione dei semi di TB alla raccolta delle radici pelose identificate, e alcuni passaggi chiave sono raffigurati nella Figura 1 (A-H). In breve, i semi sgusciati sterilizzati...

Descriviamo un metodo per indurre radici pelose da Agrobacterium rhizogenes- trasformazione mediata in grano saraceno tartario (Fagopyrum tataricum). Questo può essere utilizzato per studiare le funzioni geniche e la produzione di metaboliti secondari nel grano saraceno tartario, essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica, o utilizzato per altre piante medicinali dopo il miglioramento.

Indurre radici pelose di Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Utilizzando questo protocollo, dimostreremo il processo passo dopo passo per indurre per la prima volta radici pelose nel grano saraceno di tartaria. Questa tecnica è facile ed economica per iniziare a genomica e microbiomica per il grano saraceno di tartaria e altre piante. Sebbene questo metodo dettagliato sia impostato per il grano saraceno di tartaria, può essere applicato ad altre piante di dicot con alcune modifiche.Sebbene questo metodo sia facile da eseguire, ha molti passaggi dettagliati. La dimostrazione visiva può aiutare i ricercatori a ottenere un'induzione della radice pelosa più efficiente. A dimostrare la procedura sarà Guangtao Qian, uno studente di Master del mio laboratorio.Inizia selezionando semi di grano saraceno di tartare paffuto e integro e immergendo i semi in acqua di 28 gradi Celsius per circa 20 minuti. Quando il rivestimento del seme può essere facilmente rimosso, posizionare da 100 a 200 semi pelati in un matraccio conico sterilizzato da 100 millilitri contenente 75% di etanolo per 30 secondi. Al termine della sterilizzazione, sostituire l'etanolo con il 5% di ipoclorito di sodio.Dopo 15 minuti, decantare l'ipoclorito di sodio e lavare i semi con acqua deionizzata sterile cinque volte. Quindi asciugare i semi con un pezzo di carta bibulosa sterile. Per ottenere piantine di grano saraceno alla tartaria, aggiungere 10 semi per bottiglia a singole bottiglie di coltura di tessuti vegetali da 300 millilitri contenenti 50 millilitri di mezzo MSSA.Quindi, germinare i semi in una stanza di coltura a 25, più o meno 1, gradi Celsius in condizioni di luce. Dopo 7-10 giorni, seleziona piantine robuste con due pezzi di cotyledon spiegati e taglia le piantine dalle radici. Posizionare le piantine in una piastra di petri sterile e tagliare gli ipoccotili in segmenti da 0,8 a 1 centimetro.Inchioda i cotyledon in pezzi di circa 0,5 centimetri e pre-coltura gli espianto risultanti in condizioni di luce per 24 ore. Il giorno dopo, trasferire le espianto in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri. Per attivare gli A.rhizogenes, scongelare la coltura sul ghiaccio prima di placcare uniformemente i batteri su un mezzo solido YEB con antibiotici per un'incubazione da 12 a 16 ore a 28 gradi Celsius.La mattina dopo, scegli una colonia monoclonale per la cultura in una nuova piastra di Petri come appena dimostrato. Dopo un'altra incubazione da 12 a 16 ore, inoculare le colonie monoclonali risultanti in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri contenente 20 millilitri di mezzo solido YEB con antibiotici a 28 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 16-18 ore fino a quando la densità ottica a 600 raggiunge 2,0. Quindi trasferire il 2-4% della coltura cellulare batterica in un nuovo pallone conico da 100 millilitri contenente 20 millilitri di mezzo solido YEB fresco con antibiotici a 28 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 4-5 ore fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge circa 0,5.Per indurre la trasformazione della radice pelosa, trasferire la coltura di A.rhizogenes in un tubo conico sterile da 50 millilitri e raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in mezzo MSSAS a una densità ottica di circa 0,2 e infondere la sospensione nel pallone delle espianto. Dopo 10 minuti, rimuovere le espianto dal pallone e tamponarle con un pezzo di carta bibulosa sterile.Quindi posizionare un pezzo sterile di carta da filtro di 9 centimetri di diametro su un piatto di mezzo MSSAAS e sovrapporre le espianto sulla carta filtrante per un'incubazione di tre giorni a 25 gradi Celsius al buio. Alla fine dell'incubazione, trasferire circa 20 espianto infetti su mssack medio e incubare verticalmente le piante in condizioni di luce a 25, più o meno 1, gradi Celsius. Dopo 10-14 giorni di cultura, seleziona le radici pelose dimostrando un aspetto bianco e una rapida crescita e taglia le radici in pezzi da due a tre centimetri.Numera chiaramente le radici su una panchina pulita. Sottocultura i pezzi di radice in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri contenente mezzo MSSK a 25 gradi Celsius e 80 giri al minuto al buio fino a quando non si dispendono troppo sul fondo del pallone. Per identificare le radici pelose, rimuovere eventuali radici pelose e contaminate e selezionare quelle con un aspetto bianco.Se è stato utilizzato un gene reporter, controllare le radici per la fluorescenza sotto un transilluminatore blu o chiaro doppio ultravioletto e selezionare le radici pelose che mostrano un forte segnale fluorescente. Quindi asciugare le radici con carta assorbente e avvolgerle in un foglio di alluminio marcato per un'analisi immediata. Per la conservazione a lungo termine, lyophilize le radici in azoto liquido e posizionare le radici a meno 80 gradi Celsius fino alla loro indagine.Dopo la trasformazione genetica e la cultura, come dimostrato, le radici pelose mostreranno un colore bianco soffice e un modo plagiotropico nei siti di ferita delle espianto e formeranno una matrice altamente ramificata e interconnessa. Un gene reporter può essere usato per facilitare la differenziazione delle radici pelose transgeniche sotto una transilluminazione ultravioletta doppia blu o chiara, o l'identificazione di un gene bersaglio di interesse. Qui, viene mostrata l'espressione relativa di un fattore di trascrizione indotto dalla luce nelle linee transgeniche delle radici pelose di grano saraceno di tartaria.In particolare, la biosintesi della rutina e della quercetina sono promosse anche a livello metabolico in risposta alla sovraespressione del fattore di trascrizione indotto. Inoltre, l'espressione genica relativa dei geni della via di sintesi flavenoide in tutte e tre le linee transgeniche, è notevolmente superiore a quelle misurate nel gruppo di controllo, indicando una trasformazione positiva delle radici pelose negli espianto di grano saraceno di tartaria. Cioè l'infezione dei semi, la selezione delle espianto e la concentrazione dei batteri influenzano direttamente il successo dell'induzione della radice pelosa.Possiamo valutare l'espressione genica, le reazioni proteiche del DNA o delle proteine o la produzione di massa di metaboliti secondari per studiare i metaboliti secondari di regolazione trascrizionale. I batteri ingegnerizzati sono pericolosi per l'uomo e il suo ambiente. Fare attenzione a maneggiare, utilizzare e smaltire correttamente i batteri.

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Qui, presentiamo due protocolli per trasformare piante di patate. La trasformazione di Agrobacterium tumefaciens conduce ad una pianta transgenica completa mentre l' Agrobacterium rhizogenes produce radici transgeniche pelosi in un tiro di tipo selvatico che può essere auto-propagato. Individuiamo quindi l'attività del promotore di GUS colorazione nelle radici trasformate.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e l'attività del promotore di un Gene di suberina da GUS Staining

A causa della sua versatile applicazione come specie modello in vari campi di studio, vi è la necessità di un kit di strumenti di trasformazione genetica nella piantaggine a foglia stretta (Plantago lanceolata).  Qui, utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens, viene presentato un protocollo che si traduce in linee transgeniche stabili con un'efficienza di trasformazione del 20%.

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Qui, presentiamo un protocollo per la produzione ad alta efficienza di radici pelose di soia transgeniche.

Trasformazione della radice pelosa di soia per l'analisi della funzione genica

Qui, forniamo il protocollo dettagliato di un metodo di trasformazione in un'unica fase mediato da Agrobacterium tumefaciens per produrre piante composite.

Un metodo efficiente e riproducibile per la produzione di piante composite mediante trasformazione delle radici pelose a base di Agrobacterium rhizogenes

Il protocollo descrive l'induzione della radice pelosa utilizzando steli di infiorescenza primaria di Arabidopsis e ipocotili di Brassica napus . Le radici pelose possono essere coltivate e utilizzate come espianti per rigenerare piante transgeniche.

Trasformazione e rigenerazione delle radici pelose in Arabidopsis thaliana e Brassica napus

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

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L'oogenesi della Drosophila continua ad essere eccezionalmente utile nello studio della proliferazione e dell'ereditarietà mitocondriale. Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato utilizzato per marcare il DNA mitocondriale replicante (mtDNA) nelle ovaie adulte di Drosophila con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), che facilita la scoperta di meccanismi associati all'eredità mitocondriale che erano precedentemente discutibili.

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Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l'integrazione del transgene.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Mutanti di delezione genica generati attraverso la ricombinazione omologa sono il gold standard per gli studi di funzione genica. Viene descritto il metodo OSCAR (costruzione di una fase di Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) per una rapida generazione di costrutti di delezione. La trasformazione fungina mediata da Agrobacterium segue. Infine, viene presentato un metodo di conferma basato su PCR delle delezioni geniche nei trasformanti fungini.

Produzione rapida del taglio nei funghi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Trasformazione mediata di componenti di eliminazione OSCAR

Qui, presentiamo un protocollo per spazialmente e temporalmente valutare la presenza del microbiota praticabile nelle viscere di segno di spunta utilizzando un approccio modificato intero-monta l'ibridazione in situ.

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Scopri l'induzione di radici pelose in grano saraceno tartarico mediante trasformazione con Agrobacterium rhizogenes. Questo metodo semplice e economico facilita studi genomici e metabolici nelle piante dicotiledoni.

Indurre radici pelose di Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

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