Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

Le cellule sintetiche produttrici di proteine offrono una piattaforma versatile per studiare le origini della vita e le terapie a base di cellule sintetiche per la somministrazione avanzata di farmaci. Questo metodo è semplice e conveniente per l'espressione di RNA e proteine e può essere applicato per la produzione di proteine terapeutiche in loco direttamente all'interno del corpo. I sistemi possono essere utilizzati per il trattamento di una vasta gamma di malattie, dalle malattie metaboliche e sostituzioni proteiche al cancro e possibilmente al diabete.

Questo protocollo in più istruzioni ha un punto di arresto definito. Quando lo si esegue per la prima volta, si consiglia di dividere il lavoro per diversi giorni. Il protocollo per la produzione di celle sintetiche inizia con la preparazione del llysato S30-T7 senza cellule.

Successivamente, i lipidi della membrana e la soluzione nutritiva cellulare sono preparati per simulare l'ambiente interno e sostenere la produzione di proteine. Il passo finale è la preparazione delle cellule sintetiche stesse. Preparare colture di avviamento duplicate in matracci Erlenmeyer da 100 millilitri.

Ad ogni pallone aggiungere cinque millilitri di supporti LB integrati con 50 microgrammi per millilitro di ampicillina e inoculare con una singola colonia E.coli. Fai crescere la cultura durante la notte in uno shaker per incubatori di pavimenti a 250 giri/min e 37 gradi Celsius. Successivamente, preparare due matracci Erlenmeyer sconcertati da due litri contenenti 500 millilitri di mezzi tb integrati con 50 microgrammi per millilitro di ampicillina.

Inoculare ogni pallone da due litri con una coltura iniziale di cinque millilitri. Posizionare le fiasche in uno shaker a 250 giri/min e 37 gradi Celsius. Monitora periodicamente le colture utilizzando uno spettrofotometro e fai crescere le culture fino a OD600 tra 0,8 e uno.

Per indurre l'espressione di T7 RNA polimerasi, aggiungere ad ogni pallone tre millilitri di IPTG millimolare per raggiungere 0,6 millimolare. Continua a coltivare le culture fino a quando OD600 non ha circa quattro anni. Dopo che le colture raggiungono la densità ottica desiderata, trasferire la sospensione da ogni pallone Erlenmeyer in due tubi di centrifuga sterilizzati da 250 millilitri.

Centrifugare i tubi a 7.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante. Resuspend ogni pellet in 250 millilitri di tampone di lisato S30 freddo utilizzando un agitatore, se lo si desidera.

Centrifuga a 7.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare tutti i pellet insieme in 15 millilitri di tampone di lisato S30 freddo. Filtrare la sospensione utilizzando cuscinetti di garza.

Prima di procedere al passaggio successivo, preraffreddare le punte in flaconcini da 1,5 millilitri che saranno necessari per conservare il lisato. Omogeneizzare la sospensione due volte. Utilizzare una pressione di lavoro di 15.000 PSI con una pressione dell'aria di quattro barre per la rottura delle cellule.

Raccogli l'omogeneato. Aggiungere 100 microlitri di DTT molare 0,1 per 10 millilitri della sospensione omogeneizzata. Centrifugare la sospensione a 24.700 volte g a 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Il DTT e il cloroformio sono classificati come irritanti e nocivi e devono pertanto essere trattati con cura. Il cloroformio utilizzato più avanti nel protocollo deve essere utilizzato in una zona con aspirazione dei fumi. Per preservare l'attività di lysate, eseguire rapidamente il passaggio.

Posizionare 200 aliquote microliter di supernatante in flaconcini pre-raffreddati e schioccare immediatamente congelarli con azoto liquido. Conservare le fiale a -80 gradi Celsius per un uso futuro. Sciogliere separatamente POPC e colesterolo in cloroformio ciascuno a una concentrazione finale di 100 milligrammi per millilitro.

Vortice ogni flaconcino separatamente. Unire i componenti in una fiala di vetro a due millilitri. Aggiungere 50 microlitri della soluzione colesterolo-cloroformio, 50 microlitri della soluzione POPC-cloroformio e 500 microlitri di olio minerale.

Vortice il flaconcino, quindi per evaporare il cloroformio, riscaldarlo per circa un'ora a 80 gradi Celsius in una cappa chimica. Prima di iniziare la fase di produzione delle cellule sintetiche, preparare le soluzioni esterne, pre-interne e di alimentazione come descritto nel manoscritto. Quindi posizionare 1,2 millilitri della soluzione esterna in un tubo da 15 millilitri e aggiungere lentamente uno strato di 500 microlitri di soluzione lipidica nell'olio dal primo flaconcino di vetro.

Incubare il tubo a temperatura ambiente per 20 minuti. Per finalizzare la preparazione della soluzione interna, mescolare sul ghiaccio ad un volume finale di 100 microlitri aggiungendo litolato S30-T7 e plasmide di DNA. Aggiungere 100 microlitri della soluzione interna con litolato e plasmide alla seconda fiala di vetro a due millilitri con 500 microlitri di soluzione lipidica nell'olio.

Pipetta su e giù vigorosamente per un minuto e poi vortice per un altro minuto al livello cinque. Dopo aver incubato l'emulsione risultante per 10 minuti sul ghiaccio frantumato, aggiungere lentamente l'emulsione sopra la fase dell'olio nel tubo da 15 millilitri. Centrifugare il tubo per 10 minuti a 100 volte g e quattro gradi Celsius.

Quindi centrifugare per 10 minuti a 400 volte g e quattro gradi Celsius. Entro la fine della centrifugazione, un pellet dovrebbe essere osservabile nella parte inferiore del tubo. Per estrarre il pellet, rimuovere prima lo strato di olio in eccesso.

Successivamente, caricare una punta di pipetta tagliata con circa 400 microlitri di soluzione esterna e utilizzare la punta della pipetta per raccogliere il pellet, rilasciando la soluzione esterna mentre la punta della pipetta passa attraverso la fase dell'olio. Pulire la punta della pipetta e trasferire il pellet in un tubo pulito da 1,5 millilitri. Centrifugare il pellet per 10 minuti a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius.

Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 100 microlitri di soluzione di alimentazione. Per l'espressione proteica, incubare la sospensione per due ore a 37 gradi Celsius senza tremare. I plasmidi che esprimevano la proteina modello sfGFP e Renilla luciferasi sono stati introdotti nella sintesi proteica priva di cellule, nelle reazioni alla rinfusa CFPS e nelle cellule sintetiche.

La produzione di proteine è stata valutata con diversi metodi. L'analisi western blot ha rilevato la produzione di sfGFP His6 sia nelle reazioni alla rinfusa CFPS che all'interno delle cellule sintetiche. SfGFP Purificato His6 è stato usato come controllo positivo.

Un microscopio fluorescente con un Brightfield e un filtro GFP mostrano cellule sintetiche che producono sfGFP. La citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare sfGFP producendo cellule sintetiche. Il calcolo della popolazione attiva di cellule sintetiche si è basato sulla soglia di intensità della fluorescenza sfGFP definita dal campione di DNA negativo rappresentato dall'istogramma rosso.

L'intensità media di fluorescenza delle cellule sintetiche produttrici di sfGFP è stata calcolata dalla popolazione attiva di cellule sintetiche e normalizzata al campione di DNA negativo. Le distribuzioni di diametro delle cellule sintetiche attive sono state calcolate in base al segnale sfGFP. L'attività della renilla luciferasi è stata quantificata con misurazioni della luminescenza.

Questo metodo è altamente versatile e può essere ottimizzato per diverse proteine bersaglio alterando l'origine del glisato, la composizione lipidica e le concentrazioni di soluzione interna. L'analisi FACS delle cellule sintetiche che producono una proteina marcatore fluorescente potrebbe essere eseguita per fornire un valore quantitativo della frazione delle cellule sintetiche attive. L'analisi western delle macchie misurerebbe la produzione di proteine.