Progettazione di sensori proteici intracellulari in cellule di mammifero

Marina Duhkinova; Claudia Crina; Ron Weiss; Velia Siciliano

doi:10.3791/60878

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Articolo metodologico

Progettazione di sensori proteici intracellulari in cellule di mammifero

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DOI:

10.3791/60878

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28 aprile 2020

Marina Duhkinova¹ , Claudia Crina¹ , Ron Weiss² , Velia Siciliano¹

¹Istituto Italiano di Tecnologia, ²Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per l'ingegnerizzazione di sensori-attuatori proteici intracellulari geneticamente codificati. Il dispositivo rileva in modo specifico le proteine bersaglio attraverso gli anticorpi intracellulari (intracorpi) e risponde attivando l'output trascrizionale genico. Viene costruito un quadro generale per sostituire rapidamente gli intracorpi, consentendo il rilevamento rapido di qualsiasi proteina desiderata, senza alterare l'architettura generale.

Abstract

Le proteine possono funzionare come biomarcatori di condizioni patologiche, come malattie neurodegenerative, infezioni o sindromi metaboliche. L'ingegnerizzazione delle cellule per rilevare e rispondere a questi biomarcatori può aiutare la comprensione dei meccanismi molecolari alla base delle patologie, nonché per sviluppare nuove terapie cellulari. Sebbene siano stati sviluppati diversi sistemi in grado di rilevare le proteine extracellulari, mancava una struttura modulare che potesse essere facilmente reingegnerizzata per rilevare diverse proteine intracellulari.

Qui, descriviamo un protocollo per implementare una piattaforma genetica modulare che rileva le proteine intracellulari e attiva una specifica risposta cellulare. Il dispositivo opera su anticorpi intracellulari o piccoli peptidi per rilevare con elevata specificità la proteina di interesse, innescando l'attivazione trascrizionale dei geni in uscita, attraverso un modulo di attuazione basato sulla proteasi TEV (TEVp). La TEVp è una proteasi virale che scorpore selettivamente i peptidi corti affini ed è ampiamente utilizzata in biotecnologia e biologia sintetica per la sua elevata ortogonalità al sito di scissione. In particolare, abbiamo ingegnerizzato dispositivi che riconoscono e rispondono ai biomarcatori proteici delle infezioni virali e delle malattie genetiche, tra cui l'huntingtina mutata, la serina-proteasi NS3, le proteine Tat e Nef per rilevare rispettivamente la malattia di Huntington, il virus dell'epatite C (HCV) e il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). È importante sottolineare che il sistema può essere adattato a mano per il risultato funzionale input-output desiderato, come le letture fluorescenti per i biosensori, la stimolazione della presentazione dell'antigene per la risposta immunitaria o l'inizio dell'apoptosi per eliminare le cellule malsane.

Introduzione

Lo studio e la modulazione delle risposte cellulari tramite circuiti genici ingegnerizzati controllabili sono obiettivi importanti in biologia sintetica ^1,2,3 per lo sviluppo di strumenti prospettici con applicazioni biologiche o mediche rilevanti nel cancro 4, nelle infezioni⁵, nelle malattie metaboliche⁶ e nell'immunologia⁷.

La riprogrammazione delle funzioni cellulari in risposta a segnali specifici richiede la proget....