Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

Con TRAP, possiamo indagare l'elaborazione dello sviluppo a risoluzione cellulare. Usiamo promotori specifici del tipo di cella per guidare una sotto-unità ribosomiale taggata, e da lì possiamo isolare l'RNA polisoma. Questo protocollo produce RNA di alta qualità, ma in quantità molto limitate, quindi, sono necessari metodi specializzati per l'input ultra-basso per produrre in modo affidabile librerie di RNA di alta qualità.

TRAP è uno strumento ideale per la ricerca vegetale, perché molti processi di sviluppo si basano su percorsi di segnalazione meccanica e legati alla parete cellulare. Usiamo TRAP per studiare la comunicazione cellula-cellula nella formazione delle radici lateralmente. Poiché ottenere un RNA di buona qualità non è stato così semplice come avevamo previsto, speriamo che questa istruzione video passo-passo aumenti l'applicabilità trap e contribuisca a promuovere questa potente tecnica.

Per sterilizzare le linee omozigote propagate, stendere in modo uniforme meno di 300 microlitri di semi su piastre petri quadrate di 12 per 12 centimetri e impilare i piatti su un essiccatore da 60 litri. Dopo la sterilizzazione del gas durante la notte, lasciare evaporare il gas prima di raccogliere i semi in un tubo di stoccaggio da 50 millilitri. Prima della placcatura, diluire i semi sterilizzati con lo 0,1% di agar per ottenere un millilitro di miscela di semi imbibati per piatto.

Per placcare il mix di semi, utilizzare coperchi quadrati della piastra di Petri per creare un porta modello laminato per piantare tre file di semi per piatto e posizionare le piastre di agar vuote nel supporto del modello. Distribuire uniformemente un millilitro dei semi imbibati su tre file di piatti. E posizionare le piastre lavorate in pile in un flusso laminare, fino a quando i semi sono asciutti.

Quando i semi si sono attaccati alla superficie dell'agar, chiudere i coperchi e sigillare ogni piastra con nastro micropore. Per il trattamento esogeno delle radici di Arabidopsis con un agente di interesse, preparare strisce di carta velina larghe da 1,5 a due centimetri, lunghe 10 centimetri. Immergere la carta velina in NAA micromolare 10 e utilizzare una pinzetta per applicare una striscia di carta velina su ogni riga di radici.

Quindi, premere delicatamente eventuali bolle d'aria e svuotare il liquido in eccesso dalla piastra, prima di etichettare la piastra con il tempo. Nel punto finale sperimentale appropriato, utilizzare le forcelle per rimuovere con cura le strisce di carta velina da ogni piastra senza staccare le radici e utilizzare una lama chirurgica per tagliare una volta per fila lungo la giunzione shoot-root, in un singolo tratto determinato. Usa le pinzette per scorrere lungo le radici di ogni riga, per raccogliere le radici in tre fasci.

E svuotare le radici in un tubo da 50 millilitri riempito con azoto liquido, per il congelamento a scatto. Una volta raccolti tutti i campioni di radice per trattamento, decantare l'azoto liquido in eccesso utilizzando il coperchio del tubo per evitare che le radici si riversano. E posizionare il tubo in un vaso doer, per uno stoccaggio di 80 gradi celsius.

Per la macinazione e l'omogeneizzazione dei tessuti, indossare guanti di cotone sotto guanti da laboratorio standard e aggiungere PMSF al tampone di estrazione polisoma. Svuotare il campione di tessuto in una malta contenente azoto liquido e utilizzare un pestello raffreddato per macinare accuratamente i tessuti fino a quando tutto il materiale appare come polvere bianca. Quando tutto il tessuto è stato macinato, aggiungere cinque millilitri di tampone di estrazione polisoma al campione e mescolare rapidamente i frammenti di tessuto congelato con la polvere prima che il tampone si congeli.

Non appena la miscela può essere trasferita, svuotare il liquame in un omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio e utilizzare altri due millilitri di tampone di estrazione poliosoma per risciacquare la malta e il pestello. Macinare manualmente il liquame fino a quando l'estratto non è omogeneo. Quindi, versare l'estratto di radice grezza in un tubo di centrifuga da 50 millilitri sul ghiaccio ed elaborare il campione successivo come dimostrato.

Per la raccolta totale dell'RNA, trasferire 200 aliquote di microliter di ciascun campione grezzo in singoli tubi di microcentrifugo puliti, pre-raffreddati ed etichettati. Per rimuovere pareti cellulari, detriti e grandi organelli, centrifugare i campioni e decantare il supernatante in tubi conici freschi e pre-raffreddati per una seconda centrifugazione. Mentre i tubi girano, aliquota 60 microlitri di perline magnetiche GFP per campione, in un tubo da 1,5 millilitri.

E posizionare il tubo su un supporto magnetico, per facilitare la rimozione del supernatante. Quindi, lavare le perline due volte in un millilitro di tampone di lavaggio freddo per lavaggio e sospendere di nuovo le perline in 60 microlitri di tampone di lavaggio per campione. Immediatamente dopo la centrifugazione, decantare il supernatante autorizzato in tubi etichettati da 15 millilitri e aggiungere 60 microlitri di perline lavate a ciascun campione.

Quindi, posizionare tutti i campioni orizzontalmente in un secchio di ghiaccio, per un'incubazione di due ore con dondolo. Alla fine dell'incubazione, raccogliere le perline su un supporto magnetico sul ghiaccio e aggiungere PMSF al tampone di estrazione polisoma rimanente. Dopo aver scartato i supernaganti, aggiungere circa cinque millilitri di tampone di estrazione polisoma ai campioni e sospendere di nuovo le perline all'interno dei campioni con inclinazione delicata.

Dondolare i campioni per 15 minuti sullo shaker sul ghiaccio, seguiti da due lavaggi con tampone di lavaggio fresco sul magnete, come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i campioni in un millilitro di tampone di lavaggio, in un tubo da 1,5 millilitri. E raccogliere le perline un'altra volta sul supporto magnetico, per rimuovere tutto il supernatante.

Quindi, posizionare i tubi sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni non sono stati elaborati. Per il ricondizionamento delle forniture di laboratorio, in primo luogo, sciacquare tutte le apparecchiature nei rifiuti chimici. Lavare a mano i mortai, i pestelli e gli omogeneizzatori con sapone, prima di risciacquare accuratamente ogni strumento.

Quindi, posizionare l'apparecchiatura in un contenitore sicuro per il calore e cuocere i materiali durante la notte a più di 220 gradi celsius. Spazzolare tutti i tubi di centrifuga puliti con detersivo, prima di posizionare i tubi su un vassoio autoclavebile con un cerchio e una cappa aspirante. Versare un millilitro di dietil pirocarbonato liquido e un litro di soluzione d'acqua deionizzata sui tubi per tre o 18 ore.

Quindi, raccogliere la soluzione prima di sterilizzare il vassoio dei tubi nell'autoclave. Qui vengono mostrate piante rappresentative con segnali GFP. La contro-colorazione con ioduro di propidio segna i contorni della parete cellulare.

Le linee corrispondono al modello di localizzazione dell'endodermide e del periclo xilem-polo. In queste misurazioni rappresentative ottenute dall'RNA poliosoma, la maggior parte dei campioni ha mostrato pochissima degradazione, con numeri di integrità dell'RNA che vanno da nove a 10. In questi grafici, si possono osservare tracce di librerie preparate con successo, evidenziando la robustezza della procedura, nonostante i volumi di reazione ridimensionati.

Prima di produrre un set di dati di spanning del genoma, l'RNA TRAP di un esperimento pilota può essere sondato da RTPCR quantitativo per convalidare il successo del trattamento e / o le condizioni sperimentali, nonché la specificità dei tessuti. In questa analisi, il test di tre geni reattivi all'auxina ha confermato un'induzione ormonale di successo dopo due ore di trattamento. I profili genetici marcatori specifici dei tessuti recuperati dai dati di sequenziamento hanno confermato la specificità del tipo di cellula.

Segui i consigli sulle buone pratiche quando gestisci l'RNA. Lavora su una panchina sterile, pulisci la tua attrezzatura con la soluzione di rimozione dell'RNA, indossa i guanti e cambiali immediatamente quando vengono contaminati. Assicurarsi di maneggiare e scartare in modo appropriato tutte le sostanze chimiche tossiche e i gas utilizzati durante la procedura, in particolare il gas cloro fenolo-DEPC e l'azoto liquido.

Nel portafoglio degli studi omici, TRAP occupa una nicchia importante ed è già stato utilizzato per rispondere a molte domande biologiche, specialmente nella biologia dello sviluppo, trap ha un enorme potenziale.