Attacco covalente di singole molecole per la spettroscopia della forza basata su AFM

La spettroscopia a forza a singola molecola ci consente di misurare parametri fisici che descrivono le proprietà meccaniche e adesive dei polimeri. Quando si utilizza la spettroscopia di forza basata su AFM per studiare singole molecole, è essenziale disporre di un protocollo affidabile ed efficiente per legare queste molecole in modo covalente a una punta a sbalzi AFM. Questo protocollo può essere adottato in molti polimeri diversi indipendentemente dalla lunghezza del contorno o dall'idrofobicità.

Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa aspirante per evitare l'inalazione di vapori organici. Inoltre, sono necessari vetro resistente ai solventi, camice da laboratorio e protezione degli occhi. Utilizzare innanzitutto una pinzetta appena pulita per posizionare i trucioli di sbalzo AFM nella camera al plasma.

Avviare il programma di attivazione della superficie della camera al plasma selezionando start e quindi yes. Verificare che il processo plasmatico funzioni correttamente. Un processo al plasma ad alto contenuto di ossigeno mostra un colore azzurro.

Durante l'esecuzione del programma di attivazione della superficie, sciogliere silane-PEG-mal in toluene per ottenere una concentrazione di 1,25 milligrammi per millilitro. Posizionare tre millilitri della soluzione in una piastra di Petri piatta. Al termine del processo al plasma, ventilare la camera del plasma selezionando conferma e quindi sfogando.

Procedere immediatamente al passaggio successivo per evitare l'assorbimento dei contaminanti. Mettere i trucioli nella piastra di Petri e incubare i trucioli per tre ore a 60 gradi Celsius. Togliere la piastra di Petri dal forno e lasciare raffreddare per almeno 10 minuti.

Quindi, sciacquare le patatine. Per peg o legatura in polistirolo, sciacquare i trucioli con toluene tre volte. Per la legatura del polinipam, i trucioli devono essere risciacquati una volta con toluene e due volte con etanolo.

Per ridurre l'impatto delle forze capillari sul sbalzino AFM, inclinare leggermente i trucioli durante il risciacquo. I trucioli di sbalzi AFM devono essere risciacquati correttamente per rimuovere qualsiasi eccesso di polimeri fisici che possa influenzare l'esperimento. Il risciacquo deve essere eseguito con attenzione per evitare danni ai cantilever AFM.

Infine, preparare almeno due trucioli per fungere da controlli che non saranno sottoposti ad attacco polimerico covalente. Per i controlli rispetto ai trucioli di PEG e polistirolo, sciacquare due volte con etanolo e una volta con acqua. Per i controlli rispetto ai trucioli di polinipam, sciacquare due volte con acqua.

Per eseguire l'attacco covalente di PEG o polistirolo, preparare tre millilitri di soluzione polimerica in toluene ad una concentrazione di 1,25 milligrammi per millilitro. Aggiungere la soluzione e i trucioli a una piastra di Petri e incubare i trucioli a 60 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione con PEG o polistirolo, lasciare raffreddare i trucioli per 10 minuti.

Risciacquare i trucioli due volte con toluene, due volte con etanolo e una volta con acqua. Per eseguire l'attacco covalente di polinipam, preparare tre millilitri di soluzione polimerica in etanolo ad una concentrazione di 1,25 milligrammi per millilitro. Aggiungere la soluzione e i trucioli a una piastra di Petri e incubare i trucioli a temperatura ambiente per tre ore.

Dopo l'incubazione con polinipam, sciacquare i trucioli due volte con etanolo e due volte con acqua. Per conservare i trucioli fino all'uso in un esperimento, posizionare ogni chip separatamente in una piastra di Petri da un millilitro piena d'acqua. Mantenere le piastre di Petri a quattro gradi Celsius.

In primo luogo, inserire il chip a sbalzi AFM funzionalizzato in un supporto per chip. Incollare la superficie preparata in un portacampioni adatto per le misurazioni in liquido. Utilizzare una pipetta per immergere il truciolo in acqua.

Montare la superficie del campione nell'AFM. Immergere la superficie del campione in acqua. Collegare il supporto del chip all'AFM.

Quindi avvicinare il chip alla superficie del campione. Utilizzare il pannello ambientale per impostare la temperatura di destinazione e attivare la modalità e i pulsanti di opzione di feedback. Quindi lasciare che il sistema equilibra per circa 15 minuti.

Per prendere una curva di estensione della forza, avvicinate la punta a sbalzi AFM alla superficie e selezionate la forza singola. La curva risultante visualizza la deflessione contro la distanza piezo con l'avvicinamento alla superficie mostrato in rosso e la retrazione mostrata in blu. Espandete la parte della curva che rappresenta il rientro della punta a sbalzi AFM nella superficie sottostante.

Per eseguire un adattamento lineare, impostate i cursori sull'attacco o sulla curva di retrazione e selezionate Aggiorna INVOLS (Update INVOLS) dal menu di scelta rapida. Il valore risultante per il valore di sensibilità della leva ottica inversa viene visualizzato nel pannello in alto a sinistra. Dopo aver ripetuto questa procedura almeno cinque volte, calcolare una media per la sensibilità della leva ottica inversa e inserire la media nel pannello.

Posizionare il sbalzino AFM ad un'altezza di circa 100 micrometri sopra la superficie selezionando sposta per pre-innestare. Per ottenere un rapporto segnale-rumore soddisfacente per lo spettro del rumore termico, impostare il conteggio medio su almeno 10 e scegliere la risoluzione di frequenza più alta possibile. Quindi, registrare lo spettro del rumore termico selezionando acquisire i dati termici.

Per adattare lo spettro del rumore termico con una semplice funzione di oscillatore armonico, espandere la porzione della curva che rappresenta il primo picco di risonanza. Selezionare quindi inizializza adattamento. Infine, perfezionare l'adattamento utilizzando il pulsante dei dati termici fit.

La rispettiva costante di forza apparirà nel pannello. Per iniziare a raccogliere i dati, impostare i parametri per l'esperimento. Impostare la velocità di trazione su un micrometro al secondo e il trigger di forza su un nanonewton.

Avvicinati alla punta a sbalzi AFM sulla superficie e seleziona una singola forza per registrare una singola curva e determinare se i parametri devono essere regolati come descritto nel manoscritto. Selezionate Mappa F dal pannello master. Per ottenere una mappa di forza con 100 curve, impostate il numero di punti di forza e linee di forza su 10.

Iniziare a registrare la mappa di forza selezionando la mappa do F. Prendi curve di estensione della forza in modo simile a una griglia per evitare qualsiasi effetto di superficie locale e per mediare diverse aree di superficie. Dopo l'esperimento, ripetere la determinazione della sensibilità della leva ottica inversa e della costante di molla per verificare la consistenza e la stabilità del sistema.

I singoli polimeri polynipam e PEG erano legati covalentemente a una punta a sbalzi AFM ad un'estremità e physisorbed sulla superficie del biossido di silicio all'altra estremità. Per misurare il comportamento di allungamento dipendente dalla temperatura, è stato identificato un chiaro evento di allungamento a singola molecola seguito da un massimo finale alla fine della rispettiva curva di estensione della forza. Poi è stata generata una singola curva master per ogni temperatura.

Per PEG, è stata osservata una diminuzione della forza di allungamento con l'aumento della temperatura. Per il polinipam è stata osservata la tendenza opposta. Il desorbimento del polistirolo da una superficie SAM in acqua può essere utilizzato per determinare la forza e la lunghezza del desorbimento.

Quando l'attacco polimerico ebbe successo, le curve di estensione della forza mostrarono altipiani di forza costante. Ogni altopiano era dotato di una curva sigmoidale per determinare la forza di desorbimento e la lunghezza del desorbimento. Le forze di desorbimento osservate corrispondevano a valori ottenuti in precedenza.

Quando più di un polimero attaccato alla punta a sbalzi AFM, sono state osservate cascate di altipiani nelle curve di estensione della forza. Con due polimeri attaccati, fu trovata una distribuzione bimodale per la lunghezza del desorbimento, mentre la forza di desorbimento mostrò una distribuzione ristretta. Una punta a sbalzi AFM funzionalizzata può essere utilizzata per quantificare la risposta di forza di singole molecole in un ambiente liquido e con stimoli esterni.

L'uso di attrezzature pulite, solventi, punte a sbalzi AFM e risciacquo ripetuto è molto importante per raggiungere un alto livello di pulizia che dovrebbe essere confermato prima degli esperimenti controllati descritti. I protocolli e le procedure presentati hanno spianato la strada a una migliore comprensione dei sistemi polimerici reattivi agli stimoli. I risultati possono essere confrontati direttamente con simulazioni dinamiche molecolari.