Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

L'assemblaggio efficiente di strutture supramolecolari per la progettazione minima delle cellule e la somministrazione di farmaci rimane impegnativo. Qui, dimostriamo protocolli efficienti che producono strutture supramolecolari basate su proteine anfifiliche simili all'elastina. I protocolli di assemblaggio presentati generano strutture supramolecolari versatili con proprietà fisicochimiche adattabili, come vescicole, fibre e coacervate.

I compartimenti a base di membrana proteica dimostrano il comportamento di separazione di fase e consentono l'incapsulamento di molecole di carico fluorescenti chimicamente diverse. Per l'espressione di F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry, inoculare la principale cultura dell'espressione dalla pre-coltura notturna a un OD600 di 0,3. Incubarlo in 400 millilitri di mezzo LB sterile integrato con antibiotici appropriati a 37 gradi Celsius e 200 giri/min.

Quando la coltura di espressione raggiunge OD600 da 0,5 a 0,8, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di un millimolare e ridurre la temperatura di incubazione a 20 gradi Celsius. Per l'espressione dell'ELP anfifilo con l'amminoacido innaturale, inoculare la principale coltura di espressione dalla precoltura E.coli notturna contenente i plasmidi appropriati a un OD di 0,3. Incubarlo in 400 millilitri di mezzo LB sterile integrato con kanamicina e cloramfenicolo a 37 gradi Celsius e 200 giri/min.

Per preparare lo stock di amminoacidi innaturali da 100 millimolari, aggiungere 206,2 milligrammi di amminoacido innaturale a otto millilitri di acqua ultrapura. Aumentare il pH della soluzione con idrossido di sodio trimolare e mescolare vigorosamente. Quando l'amminoacido innaturale viene sciolto, abbassare il pH a circa 10,5 e aggiungere acqua ultrapura a un volume di 10 millilitri.

Filtrare la soluzione con un filtro sterile da 0,22 micrometri e aliquotarla in tubi di reazione a due millilitri. Quando la coltura di espressione raggiunge od600 da 0,5 a 0,8, aggiungere l'amminoacido innaturale a una concentrazione finale di due millimolari. Incubarlo per altri 10 minuti.

Quindi indurre l'espressione della proteina bersaglio e del tRNA sintetasi necessario attraverso l'aggiunta simultanea di IPTG e arabinosi. Ridurre la temperatura di incubazione a 20 gradi Celsius e consentire all'espressione di continuare per circa 20 ore. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule per centrifugazione a quattro gradi Celsius e 4.000 volte g per 40 minuti.

Rimescolare il pellet cellulare in tampone dilisi con glisozima e PMSF. Incubare la soluzione per 30 minuti sul ghiaccio. Quindi congelarlo e scongelarlo due volte immergendosi nell'azoto liquido.

Sonicare la sospensione e cancellare il lysate per centrifugazione a 10.000 volte g e quattro gradi Celsius per 40 minuti. Quindi purificare la proteina usando la cromatografia di affinità. Dopo l'eluizione proteica, conservarla a quattro gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.

Aggiungere un microlitro di colorante fluorescente a 500 microlitri di soluzione ELP e incubare la reazione per circa 10 ore a 15 gradi Celsius mentre si trema in un ThermoMixer, assicurandosi di proteggerla dalla luce. Per rimuovere l'eccessivo colorante fluorescente, equilibrare una membrana di dialisi in acqua ultrapura per 10 minuti. Tagliare la membrana nella dimensione corretta da posizionare sopra l'apertura del tubo di reazione con la soluzione ELP cliccata.

Quindi fissare la membrana all'apertura chiudendo il tubo con un coperchio che non ha nucleo. Riempire lo spazio tra coperchio e membrana con tampone per evitare l'intrappolamento dell'aria. Quindi posizionare il tubo di reazione nel buffer scelto, spingerlo sotto la superficie e capovolgerlo.

Eseguire la dialisi per almeno tre ore a quattro gradi Celsius, consentendo alla dialisi di continuare per almeno altre tre ore dopo ogni modifica del buffer. Per il gonfiore THF, dializzare la soluzione ELP omogenea contro il fosfato o il tampone Tris con pH stabile 7.5. Preparare il liofilizzatore e raffreddarlo a temperatura iniziale per la liofilizzazione.

Aliquota la soluzione proteica dializzata in tubi di reazione da 1,5 millilitri e sigillare con tappi con un piccolo foro per evitare di perdere il campione solido a causa di cambiamenti di pressione nel corso della liofilizzazione. Congelare i campioni in azoto liquido. Prelevare i campioni di proteine congelate dall'azoto liquido e posizionarli immediatamente nel liofilizzatore per iniziare la liofilizzazione.

Dopo che il campione è completamente asciutto, ventilare con azoto secco e chiudere immediatamente i coperchi del tubo di reazione per evitare il contatto con l'umidità dell'aria. Aggiungere THF puro ai campioni lyophilizzati e posizionare la soluzione in un sonicatore da bagno d'acqua con acqua ghiacciata per 15 minuti. Preriscaldare un termociclo a 30-60 gradi Celsius per la formazione di vescicola o fino a 90 gradi Celsius per la formazione di fibre e preparare nuovi tubi di reazione con acqua ultrapura o tampone.

Dopo la sonicazione, posizionare la soluzione ELP/THF e l'acqua o il tampone preparati nel termociclometro per cinque minuti. Quindi stratificare la soluzione ELP sopra l'acqua o il tampone, assicurandosi che la separazione delle due fasi e di un'interfase distinta sia visibile, e riposizionare la miscela nel termociclo. Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti e procedere con la dialisi contro acqua o tampone o con microscopia a fluorescenza.

Preparare una soluzione ELP da uno a 50 micromolare e aggiungere dal 10 al 20%1-butanolo. Mescolare immediatamente la soluzione tubazione su e giù. La torbidità della soluzione dovrebbe aumentare durante la miscelazione, indicando la formazione di vescicola.

Per ottenere una distribuzione di dimensioni ridotte, estrudere le vescicole con un mini estrusore attraverso una membrana con una dimensione dei pori di un micrometro. Per l'incapsulamento del colorante, mescolare circa 40 microlitri di soluzione ELP in Tris-HCl da 10 millimolari con un microlitro di soluzione stock Dextran Texas Red in DMSO. Aggiungere 10 microlitri di 1-butanolo ed estrudere da cinque a 10 volte attraverso una siringa dotata di un ago da 0,25 per 25 millimetri.

Il metodo di gonfiore THF è composto da tre fasi successive e si traduce in diversi gruppi supramolecolari dell'ELP a seconda della temperatura. Le immagini della microscopia a epifluorescenza mostrano vescicole assemblate da BDP-R20F20 e strutture fibrillari assemblate da BDP-R40F20. Il metodo di estrusione 1-butanolo porta esclusivamente alla formazione di vescicole ELP.

Circa due ordini di grandezza vengono prodotte più vescicole rispetto al metodo di gonfiore THF. Il BDP-R40F20 è stato miscelato con butanolo dal 10 al 15% e le vescicole sono state preparate tramite estrusione della miscela. Diverse strutture supramolecolari sono state assemblate da BDP-R40F20 tramite il protocollo di gonfiore THF.

Il pH del tampone e la temperatura del processo di assemblaggio sono stati regolati per formare coacervate, fibrille o vescicole. Piccoli errori nel protocollo di assemblaggio possono portare alla formazione di aggregati. Il colorante caricato positivamente ATTO Rho 13 e il polisaccaride dextran rosso 3000 sono stati incapsulati nel lume di vescicole assemblate da F20R20-mEGFP tramite il metodo di estrusione 1-butanolo.

Le immagini della microscopia confocale mostrano le vescicole nel canale verde, il carico nel canale rosso e l'incapsulamento riuscito nel canale unito risultante. È stato anche dimostrato il comportamento di separazione di fase e fusione degli anfifili ELP dopo la miscelazione di singoli elementi costitutivi PMBC rispetto alle popolazioni PMBC assemblate. La miscelazione prima dell'assemblaggio di PMBC porta a molecole distribuite omogeneamente all'interno della membrana PMBC assemblata, mentre la miscelazione di popolazioni di vescicola assemblate porta a macchie di membrana di fluorescenza rossa o verde che sono visibili per almeno 20 minuti.

Quando si tenta questa procedura, è importante prestare attenzione al corretto ordine del passo e alle differenze tra il metodo di gonfiore THF e il metodo di estrusione butanolo. Seguendo questo protocollo, le vescicole ELP possono essere utilizzate come navette per la somministrazione di farmaci, come piattaforma per reazioni enzimatiche, come la trascrizione e la traduzione in vitro, o nella formazione di cellule minime sintetiche.