Approccio stereotassico angolato adattabile per tecniche di neuroscienze versatili

Questo protocollo è significativo in quanto è una procedura stereotassica adattabile che può essere utilizzata sia nei topi che nei ratti e può essere applicata a molte nuove tecniche neuroscientifiche. Il vantaggio principale di questa procedura stereotassica adattabile è la sua capacità di essere utilizzata per colpire regioni del cervello impegnative e difficili da raggiungere. A dimostrare la procedura sarà Chelsea Faber, una giovane e talentuosa ricercatrice post-dottorato in laboratorio.

Dopo aver verificato che il telaio e il micromanipolatore siano stati calibrati, posizionare il misuratore di altezza centrale nella presa della piastra di base del supporto della testa. Fissare il cannocchiale di centraggio nel portautensile e mirare verso il basso. Regolare la posizione del micromanipolatore fino a quando il mirino non è allineato e focalizzato sul mirino del calibro e posizionare le barre auricolari nei supporti in modo che le linee dell'indicatore su entrambi i lati siano a zero.

Utilizzare le manopole mediale-laterale e antero-posteriore sul supporto per la testa per centrare le barre auricolari nei piani X e Y sopra il mirino del misuratore di altezza centrale. Per allineare la posizione della barra auricolare sull'asse Z, rimuovere le barre auricolari dal supporto e rimuovere l'indicatore di altezza centrale. Quindi, sostituire le barre auricolari e ricentrare le barre a zero.

Quindi, mirare nuovamente verso il basso e utilizzare rispettivamente le manopole di spostamento verticale e inclinazione coronale per abbassare e ruotare le barre auricolari fino a quando il mirino rimane centrato tra le barre auricolari durante la rotazione coronale. Per allineare l'asse centrale di rotazione per le coordinate angolate, fissare il cannocchiale nel portautensile e posizionare il micromanipolatore sulla coordinata calcolata. Si noti che la coordinata destra/sinistra per l'impianto angolato corrisponde alla lunghezza del lato A.Puntando verso il basso l'endoscopio, segnare questa coordinata per rappresentare il punto in cui la cannula entrerà nel cervello, una volta ruotata la testa.

Riposizionare il micromanipolatore sulla linea mediana e utilizzare la manopola di inclinazione coronale per ruotare la testa all'angolo calcolato. Se il mirino non è allineato con il segno di riferimento, utilizzare la manopola di spostamento verticale per regolare la posizione della testa sull'asse Z fino a quando il puntatore a croce non si allinea il più vicino possibile al segno. A questo punto, il punto di rotazione arbitrario dovrebbe essere allineato con il centro di rotazione della stereotassa.

Ruotare la testa in posizione coronale di zero gradi prima di procedere alle successive fasi di perforazione e microiniezione. Dopo aver eseguito la microiniezione, riportare la testa nella posizione di livello zero e utilizzare un trapano a mano per posizionare due fori, anteriormente, e due fori, posteriormente, abbastanza lontano dai fori di bava coordinati angolati per ospitare la parte della ghiera della fibra ottica che si trova sopra il cranio. Quando tutti i fori sono stati praticati, utilizzare un piccolo cacciavite a testa piatta per inserire le viti ossee il più delicatamente possibile, in modo che si trovino saldamente nel cranio senza penetrare nel cervello.

Bloccare una cannula a fibre ottiche nel supporto della cannula e posizionare il supporto della cannula nel portautensili. Ruotare la testa all'angolo calcolato, tenendo presente che le coordinate del micromanipolatore non si applicano al nuovo utensile. Utilizzare il centro dei fori della fresa angolati come obiettivo dell'impianto.

Abbassare la fibra ottica fino a toccare appena la dura madre al centro del foro della fresa e azzerare il micromanipolatore sull'asse Z. Abbassare lentamente la fibra ottica fino alla coordinata angolata ventrale dorsale, quindi utilizzare il gel cianoacrilato per collegare la ghiera in fibra ottica alle viti di ancoraggio omolaterali. Utilizzare una punta per micropipetta per applicare un accelerante.

Una volta che il gel si è completamente indurito, allentare delicatamente e sollevare il supporto della cannula fino a quando non è lontano dalla ghiera. Impiantare la seconda fibra ottica alla coordinata angolata controlaterale, quindi livellare la testa. Per una maggiore sicurezza, utilizzare il gel cianoacrilato e l'accelerante per stabilire un collegamento aggiuntivo tra le due cannule a fibre ottiche angolate e applicare una piccola quantità relativamente sottile di cemento dentale sulla superficie del cranio, facendo attenzione a coprire accuratamente le viti di ancoraggio e la base delle cannule a fibre ottiche.

Per interrogare il ruolo dei neuroni del nucleo ventromediale dell'ipotalamo nel controllo glicemico, in questa analisi rappresentativa, è stato utilizzato un approccio stereotassico standard, non angolato, per la microiniezione bilaterale di un virus della rodopsina canale inibitorio nel nucleo ventromediale. Data la vicinanza del nucleo ventromediale alla linea mediana, i vincoli di spazio non consentivano un impianto non angolato di fibre ottiche bilaterali, rendendo necessario lo sviluppo di una strategia chirurgica per impiantare con precisione le fibre ottiche ad angolo. Le cose più importanti da ricordare sono semplicemente essere pazienti e prendersi il proprio tempo, poiché essere coerenti e accurati con i compiti coordinati è fondamentale per il successo.

Questa procedura può essere adattata e applicata a qualsiasi metodo neuroscientifico che richieda la microiniezione o l'impianto nel cervello del roditore, compresi gli approcci di chemiogenetica, optogenetica e fotometria delle fibre.