Impostazione della spettrometria di massa al plasma accoppiata capillare (CE-ICP-MS) per la quantificazione delle specie di iron Redox (Fe(II), Fe(III))
4 maggio 2020
Questo metodo di speciazione di redox di ferro si basa sulla spettrometria di massa plasmatica accoppiata con elettroforesi capillare con impilamento del campione combinato con analisi breve in una sola esecuzione. Il metodo analizza rapidamente e fornisce bassi limiti di quantificazione per le specie di redox di ferro in una vasta gamma di tessuti e campioni di biofluidi.
Il ferro eccessivo si traduce in ferro rosso-attivo libero due-plus che può causare effetti devastanti all'interno della cellula, come lo stress ossidativo e la morte cellulare per perossidazione lipidica nota come ferroptosi. Le misurazioni quantitative del ferro ferroso e ferrico sono la chiave per una visione più approfondita di questi processi dannosi. Questa tecnica CE-ICP-Ms fornisce sia:analisi rapida che bassi limiti di quantificazione, entrambi necessari per quantificare le specie ferro-redox.
Inizia selezionando un nebulizzatore con un basso volume autoaspirazione e preparando le parti appropriate per montare l'interfaccia fatta in casa. Collegare due connettori luer femmina a tre linee con un connettore cone luer maschio collegando l'estremità sinistra della barra luer a tre modi inferiore al connettore maschio e il connettore maschio alla connessione centrale del luer superiore a tre modi. Quindi, metti un tubo di un centimetro sopra il filo di platino e usa un tubo in silicone di un centimetro per collegare il primo tubo e l'ugello di un connettore luer maschio.
Fissare l'assieme alla connessione centrale del connettore luer a tre modi inferiore mediante rotazione a vite. Spingere un tubo di un centimetro sopra l'uscita del capillare CE e posizionarlo a otto-nove centimetri dall'estremità, quindi collegarlo all'ugello del connettore maschio luer con un tubo in silicone. Mettere l'intero assieme attraverso la barra del connettore T a tre modi superiore e fissare il connettore luer maschio e l'estremità sinistra del connettore luer a tre modi femmina mediante rotazione a vite.
Quindi fissare il tubo in silicone di 25 centimetri sull'ugello di un connettore luer maschio e fissare l'intero gruppo nella parte inferiore della barra dal connettore di esca a tre modi inferiore. Spingere saldamente il tubo di silicone di un centimetro, cinque millimetri sopra l'estremità del nebulizzatore. Mentre il secondo connettore cono luer maschio è collegato alla parte sporgente del tubo.
Spostare la parte di interfaccia con il capillare CE sporgente sul cono maschile al nebulizzatore, quindi inserire con cura il capillare attraverso il cono maschile e la parte più ampia del capillare nebulizzatore. Se necessario, regolare la lunghezza del capillare sporgente svitando il luer maschio di sinistra, spostando il luer con tubi attaccati nella posizione richiesta e reinstallarlo. I connettori luer a tre senso femminili superiori dovrebbero adattarsi strettamente al cono maschile.
Al termine dell'installazione procedere con ICP-Ms. Le curve di taratura sono state create per il ferro tre e il ferro due specie redox. I limiti di rilevamento erano di 3,1 microgrammi per litro per il ferro due e 3,2 microgrammi per litro per il ferro tre e la linearità è stata dimostrata fino a 150 microgrammi per litro.
L'analisi del llysato a cellule SH-SY5Y ha mostrato una migrazione leggermente più lenta per le specie di redox di ferro a causa della conduttività leggermente più elevata. Le concentrazioni misurate di ferro tre e ferro due erano rispettivamente 330 microgrammi per litro e 84 microgrammi per litro. Risultando in un rapporto ferro da due a tre di 0,25.
La fase più importante di questo protocollo è l'attento inserimento del capillare CE sporgente attraverso l'interfaccia montata e il suo adeguato posizionamento relativo al capillare nebulizzatore. I metodi qui presentati possono diventare uno strumento promettente per approfondire la comprensione dei processi molecolari dipendenti dal ferro. Sono necessari studi attentamente progettati per convalidare se la quantificazione del ferro a più di due ferri può servire come potenziale biomarcatore per individuare i tessuti a rischio di danni letali mediati dal ferro nel contesto delle malattie neurodegenerative e tumorali.
Panoramica
Questo studio presenta un nuovo metodo di speciazione redox del ferro che utilizza l'elettroforesi capillare accoppiata a spettrometria di massa con plasma accoppiato induttivamente (CE-ICP-MS). Questa tecnica consente un'analisi rapida e limiti di quantificazione bassi per le specie redox del ferro in vari tessuti e fluidi biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia molecolare
- Chimica analitica
Sfondo
- Un eccesso di ferro può provocare stress ossidativo e morte cellulare.
- La misurazione quantitativa del ferro ferroso e ferrico è fondamentale per comprendere questi processi.
- La ferroptosi è una forma di morte cellulare associata al sovraccarico di ferro.
- I metodi esistenti potrebbero non garantire la velocità e la sensibilità necessarie per la quantificazione del ferro.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido e sensibile per la quantificazione delle specie redox del ferro.
- Indagare le implicazioni della quantificazione del ferro nelle malattie neurodegenerative e nei tumori.
- Convalidare il potenziale della quantificazione del ferro come biomarcatore per il danno tissutale.
Metodi Utilizzati
- Elettroforesi capillare accoppiata a spettrometria di massa con plasma accoppiato induttivamente (CE-ICP-MS).
- Preparazione del campione che prevede l'assemblaggio di un'interfaccia realizzata in laboratorio.
- Curve di calibrazione per le specie redox del ferro due e del ferro tre.
- Analisi del lisato cellulare SH-SY5Y per la misurazione della concentrazione di ferro.
Risultati principali
- I limiti di rilevamento erano di 3,1 µg/L per il ferro due e di 3,2 µg/L per il ferro tre.
- È stata osservata una risposta lineare fino a 150 µg/L.
- Le concentrazioni misurate erano di 330 µg/L per il ferro tre e di 84 µg/L per il ferro due.
- Il rapporto tra ferro due e ferro tre è risultato essere 0,25.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è promettente per lo studio dei processi molecolari dipendenti dal ferro.
- Una configurazione accurata è fondamentale per misurazioni precise.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare il ruolo della quantificazione del ferro in contesti patologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La quantificazione accurata delle specie redox del ferro (Fe(II)/Fe(III)) è fondamentale per comprendere i danni cellulari mediati dal ferro in contesti neurodegenerativi e oncologici. Il metodo CE-ICP-MS consente una rilevazione rapida e sensibile di queste specie in matrici biologiche complesse, supportando una valutazione precoce dei meccanismi per ridurre i rischi associati a ipotesi terapeutiche che coinvolgono lo stress ossidativo e le vie della ferroptosi. Questa capacità migliora la validazione degli obiettivi fornendo biomarcatori quantitativi e specifici per il redox, utili per la selezione dei progetti nei programmi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'omeostasi redox del ferro come ipotesi terapeutica in modelli di malattia.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative specifiche per il redox per chiarire i percorsi meccanicistici della morte cellulare indotta dal ferro.
- Valore predittivo: Sostiene la fiducia nei bersagli guidata da biomarcatori, correlando i rapporti Fe(II)/Fe(III) con lo stress ossidativo e gli esiti di ferroptosi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Offre bassi limiti di rilevamento (3,1–3,2 µg/L) e risposta lineare fino a 150 µg/L, consentendo una quantificazione affidabile in lisati diluiti e fluidi biologici.
- Riproducibilità: Dimostra una precisione sui tempi di migrazione inferiore al 3% e una precisione di misura del 2,2–3,5%, garantendo risultati costanti nei test di screening dei composti.
- Scalabilità: L'accumulo basato su conducibilità e pH permette volumi di iniezione più elevati senza compromettere la separazione, migliorando la produttività nella validazione dei saggi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Consente la misurazione delle specie redox del ferro in lisati di SH-SY5Y e nel liquor cefalorachidiano, collegando la scoperta a sistemi rilevanti per la malattia.
- Decisioni basate sul rischio: L'accuratezza del recupero (97–105%) e la conferma mediante aggiunta standard supportano una quantificazione affidabile dei biomarcatori per criteri di prosegui/non prosegui.
- Riduzione del rischio meccanicistica: Facilita la valutazione di strategie di modulazione del ferro fornendo letture dirette delle specie Fe(II) e Fe(III) in modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo CE-ICP-MS si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo dati quantitativi specifici per lo stato redox che informano le fasi di convalida del bersaglio e di identificazione dei composti promettenti, in particolare per i percorsi metabolici che coinvolgono lo stress ossidativo dipendente dal ferro.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo al malfunzionamento del ferro in modelli di malattie neurodegenerative e tumorali attraverso la quantificazione risolta per specie.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi grazie a un basso limite di quantificazione (LOQ) e un'elevata precisione, facilitando la valutazione affidabile degli effetti dei composti sugli stati redox del ferro.
- Analisi: Produce output quantitativi basati sull'area dei picchi e parametri temporali di migrazione che consentono il confronto tra diverse condizioni e l'analisi di tendenze.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla validazione preclinica mediante la rilevazione di specie di ferro misurabili in lisati cellulari e fluidi biologici, supportando l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: La rilevazione agnostica alla piattaforma tramite spettrometria di massa con plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) consente il riutilizzo su molteplici bersagli elementari oltre al ferro, aumentando l'utilità a lungo termine.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica distinguendo i contributi di Fe(II) e Fe(III) allo stress ossidativo e alla ferroptosi.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità grazie alla separazione potenziata da impilamento e alla riduzione delle interferenze in modalità DRC.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo biomarcatori redox quantitativi associati a stati patologici del ferro.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base al rischio calibrato, in funzione del loro impatto sulla speciazione del ferro in modelli rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella configurazione dell'elettroforesi capillare e nell'ottimizzazione della spettrometria di massa con plasma accoppiato inductivamente, in particolare in modalità DRC con gas reattivo NH3.
- È fortemente dipendente da un'assemblaggio stabile dell'interfaccia tra il capillare CE e il nebulizzatore, necessario per mantenere l'integrità del segnale ed evitare spostamenti redox.
- Necessita di standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per i parametri dell'elettrolita di fondo (HCl 20 mM) e della tensione (+25 kV) al fine di garantire la riproducibilità.
- Richiede un'adattamento per campioni a conducibilità variabile (ad esempio, liquido cefalorachidiano) mediante aggiunta standard per confermare l'identificazione dei picchi.
- Limite pratico: la sensibilità del metodo agli effetti della matrice del campione richiede diluizione o standardizzazione per una quantificazione accurata nei fluidi biologici complessi.
