Separazione delle piccole molecole bioattive, Peptidi da fonti naturali e proteine dai microbi di Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Metodo

Il nostro protocollo descrive le nuove scoperte sulla separazione e la purificazione delle molecole attive da un estratto vegetale. Gli scienziati possono utilizzare questi metodi per isolare piccole molecole e peptidi da fonti di prodotto naturali per gli utenti terapeutici. Familiarizzare con i componenti dello strumento e i loro metodi di assemblaggio.

È importante essere sicuri che il campione da separare sia preparato dalle linee guida suggerite. Questo metodo coinvolge più processi di assemblaggio dello strumento. E la dimostrazione visiva aiuterà gli utenti a seguirli e applicarli con successo alla ricerca.

Dopo aver assemblato la fase liquida, l'unità IEF come descritto nel manuale di istruzioni, equilibra le membrane di scambio ionico con idrossido di sodio molare 0,1 e le membrane di scambio cationico con acido fosforico molare 0,1. Allineare le guarnizioni in gomma in modo che i tre grandi fori oblunghi rimangano sbloccati dalla gomma. Ciò aiuterà a scambiare gli ioni tra l'elettrodo e i compartimenti campione attraverso la membrana durante l'elettroforesi.

Assemblare la parte interna ed esterna dell'elettrodo allineando i tre fori oblunghi nelle guarnizioni di scambio ionico. Quindi riempire gli elettrodi con i rispettivi elettroliti per evitare che le loro membrane si asciughino. Quindi, stringere il supporto della vite di plastica per garantire un assemblaggio privo di perdite.

Coprire le schede di raccolta dei campioni con nastro adesivo. Quindi assemblare le parti della camera di messa a fuoco sul dito di raffreddamento ceramico nella seguente sequenza: elettrodo anodico, nucleo a membrana in nylon, camera di messa a fuoco ed elettrodo catodico. Utilizzando una siringa da 50 millilitri, riempire la camera di messa a fuoco con acqua distillata pre-raffreddata.

Per una cella IEF standard, aggiungere 60 millilitri di acqua. Collegare l'unità IEF all'acqua di raffreddamento circolante a quattro gradi Celsius. Azionare l'unità a 15 watt e 3000 volt fino a quando la tensione non si stabilizza, circa tre o cinque minuti.

Quindi, spegnere la fonte di alimentazione. Utilizzando il raccoglitore di frazioni, rimuovere l'acqua dalla cella. Risigillare le schede di raccolta con nastro adesivo.

Aggiungere 0,6 grammi di estratto vegetale gymnema silvestre, a 60 millilitri di acqua distillata. Sciogliere l'estratto vegetale mescolando in un tubo a rulli per cinque minuti. Per rimuovere le particelle insolubili, centrifugare questa soluzione a 10.000 volte G per cinque minuti.

Trasferire il supernatante in un bicchiere da 150 millilitri e aggiungere l'ampolite per creare una soluzione dell'1% in volume, circa 0,6 millilitri. Utilizzando una siringa da 50 millilitri con un ago con estremità smussata calibro 19 da 1,5 pollici, caricare questa soluzione nella cella IEF attraverso le schede di raccolta dei campioni. Quindi rimuovere la cella dal supporto e toccare la camera dell'elettrodo, per rimuovere e rimuovere eventuali bolle.

Collegare l'unità all'acqua di raffreddamento. Con l'alimentatore a costante 15 Watt iniziano il frazionamento. Eseguire l'unità IEF fino a quando la tensione raggiunge un valore costante, circa tre ore.

Dopo aver premuto il pulsante di raccolta, allineare i perni del raccoglitore di frazioni con le schede di raccolta. Spingere i perni attraverso il nastro sigillante per iniziare a raccogliere le frazioni gymnema silvestre. Coltiva una singola colonia di C.albicans e brodo di pepitone di pepitone destrosio durante la notte a 30 gradi Celsius con tremori.

Trasferire la coltura in un tubo di centrifuga e raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 10.000 volte G per cinque minuti. Dopo aver rimosso il supernatante, sospendere le cellule di lievito nel tampone e ruotare la sospensione in un tubo a rulli per un'ora a cinque gradi Celsius. Per rimuovere le cellule di lievito, centrifugare la sospensione a 10.000 volte G per cinque minuti.

Quindi filtrare l'estratto proteico attraverso un filtro da 0,45 micrometri. Trasferire l'estratto proteico in tubi di dialisi e dializzare contro l'acqua per 15 ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver stimato la concentrazione proteica, raccogliere un volume di estratto proteico contenente 500 milligrammi di proteine totali.

Diluire i 500 milligrammi di proteine in 60 millilitri di acqua contenenti l'1% di anholyte in volume. Utilizzando una siringa, caricare l'estratto proteico diluito nella cella IEF e azionare l'unità a una costante di 15 Watt per quattro ore. Poiché questo strumento utilizza un'alimentazione elettrica ad alta tensione, l'utente deve prendere tutte le precauzioni per evitare qualsiasi contatto diretto con gli elettrodi vivi.

Il raccoglitore di frazioni contiene 20 tubi di plastica, ciascuno di 12 millimetri per 75 millimetri. Ed è collegato alla pompa per vuoto. Prepararsi a raccogliere le frazioni premendo la raccolta sul pulsante.

Quindi allineare i 20 perni di raccolta sul raccoglitore di frazioni con la scheda di raccolta 20 in modo che la cella di messa a fuoco sigillata. Spingere i perni di raccolta attraverso il nastro di tenuta e allo stesso tempo accendere la pompa del vuoto. Ogni tubo raccoglierà una frazione proteica di circa tre millilitri.

Dopo aver ridotto e bollito le frazioni proteiche, analizzarle su un gel di pagina SDS al 12,5%. Macchiare il gel con la tintura Coomassie Blue e posizionarlo su un rocker a temperatura ambiente. Dopo due o tre ore trattenere il gel.

Quindi registrare l'immagine gel utilizzando un gel imager. Preparare una sospensione cellulare di lievito diluire una coltura notturna di C.albicans a un rapporto 1:1000 nel mezzo di coltura cellulare RPMI integrato con glucosio millimolare 50. Aggiungere 90 microlitri della sospensione cellulare ad ogni pozza di una piastra da 96 pozza.

Quindi, aggiungere 10 microlitri di ogni frazione G.sylvestre a pozzi separati. Come controllo negativo, aggiungere 10 microlitri d'acqua con l'1% di ampholyte in pozzi separati. Dopo aver incubato la piastra del pozzo 96 a 37 gradi Celsius per 12 ore, osservare la piastra al microscopio.

La mancanza di crescita filamentosa indica l'inibizione della conversione del lievito di C.albicans in ifa. Venti frazioni di estratto di G.sylvestre sono state ottenute mediante IEF di fase liquida. Le molecole di colore scuro, gli acidi gimnemici, migrarono e furono arricchite all'estremità anodo dell'unità.

All'estremità del catodo sono state osservate frazioni giallo chiaro traslucide. Le aliquote di ogni rifrazione di G.sylvestre sono state ridotte, bollite e risolte dalla pagina SDS. Una macchia blu coomassie mostrò una diversa banda di polipeptidi a circa cinque kilodaltoni, arricchita in frazioni da 16 a 19.

Gli acidi gimnemici nella prima frazione e le frazioni successivi non sono stati rilevati poiché non sono proteici. Tuttavia, queste molecole possono essere separate dal TLC e rilevate sotto la luce UV. La frazione 10 non conteneva una quantità rilevabile di queste piccole molecole suggerendo che la maggior parte delle piccole molecole organiche fossero arricchite in frazioni da una a tre.

Tutte le 20 frazioni di G.sylvestre sono state testate per l'inibizione della conversione da lievito a ifa e la crescita ifale in C.albicans. La maggiore inibizione è stata osservata nella frazione uno e poco o nessun'inibizione è stata osservata nelle frazioni 10 e successive. Le proteine della superficie cellulare dei C.albicans sono state frazionate utilizzando la fase liquida IEF.

E le aliquote da 18 frazioni sono state analizzate dalla pagina SDS. Le proteine arricchite erano visibili in diverse frazioni. L'inizio, piccole molecole non potevano essere separate da messa a fuoco isoelettrica perché si ritiene che non siano ambulatorie.

I nostri studi dimostrano che sono ambulatoriale, almeno settimanalmente, e questo metodo può essere ulteriormente esplorato per altre piccole molecole.