Name: Imaging a cellule vive del ciclo di vita del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza Time-Lapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri come monitorare il ciclo di vita completo di Bdellovibrio bacteriovorus mediante microscopia a fluorescenza time-lapse. Questo protocollo consente l'osservazione in tempo reale delle interazioni predatore-preda.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Science Centre Opus 2018/29/B/N'6/00539 a J.

1. Preparazione di B. bacteriovorus lysate per l'analisi microscopica
<ol><li>In una fiaschetta da 250 mL, impostare la cocultura combinando 1 mL di coltura fresca 24 h B. batteriovorus (ad esempio, HD100 DnaN-mNeonGreen/Pil-mCherry) e 3 mL di coltura prede durante la notte (ad esempio, E. coli S17-1 p-MR100) con 50 mL di buffer Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH - 7,6]) integrato con antibiotici quando necessario (qui, 50 g/mL kanamycin).</li>
	<li>Incubare la cocoltura per 24 h a 30 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min.</li>
	<li>Verificare che le cellule preda siano completamente lissete dalla microscopia a contrasto di fase montata sul liquido. A questo punto, dovrebbero essere presenti numerose cellule di attacco motile B. cellule batteriovorose e nessuna cellula E. coli o bdelloplast dovrebbe essere visibile.</li>
	<li>Filtrare la coltura B. bacteriovorus tramite un filtro di dimensione poro di 0,45 m per rimuovere tutte le celle host rimanenti. Le cellule predatorie (0,3–0,5 m x 0,5–1,4 m) penetrano liberamente in 0,45 gradi, mentre le cellule ospitanti vengono mantenute sulla superficie del filtro.</li>
	<li>Girare verso il basso il filtrato per 20 min a 2469 x g e 30oC in un tubo conico di 50 mL per raccogliere le cellule predatorie. Risuostare il pellet B. bacteriovorus in 3 mL di buffer Ca-HEPES (per un ODfinale 600 di circa 0,2) e incubare a 30 gradi centigradi e 200 giri/min per 30 min.</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule ospitante per l'invasione di B. batteriovorus
<ol><li>Utilizzare una singola colonia del ceppo ospite (E. coli S17-1 p-MR100 è raccomandato a causa di varie dimensioni delle cellule con conseguente formazione di bdelloplasts di dimensioni ineguali) per inoculare 10 mL di metà YT (0,8% di tryptone bacto, 0.5% Estratto di lievito, 0.5% NaCl [pH - 7.5]) che è stato integrato con antibiotici, se necessario (qui, 50 g/mL kanamycin). Cellule di coltura durante la notte a 37 gradi centigradi e 180 giri/min.</li>
	<li>Trasferire 2 mL di coltura E. coli durante la notte (OD600 di 3,0 USD) in una provetta da 2 mL e centrifuga a temperatura ambiente (RT) e 2469 x g per 5 min. Riespegnare il pellet in 200 L di tampone Ca-HEPES.</li>
</ol>3. Configurazione del microscopio (c'è la tabella dei materiali)
<ol><li>Pre-riscaldare una camera microscopica con un obiettivo di immersione di olio 100x a 30 gradi centigradi per almeno 1 h prima dell'uso. Questo passaggio è necessario per evitare errori nel mantenimento dello stato attivo durante l'esperimento.</li>
	<li>Accendere sia il microscopio che l'automazione della microscopia. Inizializzare il software di controllo e selezionare i filtri appropriati per acquisire immagini di contrasto e fluorescenza a campo luminoso/DIC/phase-contrast e fluorescenza, in base alle esigenze (qui: immagini BF, filtro policromo GFP/mCherry ed emissione/eccitazione per mCherry e GFP).</li>
</ol>4. Assemblaggio di layout per microscopia a fluorescenza time-lapse
<ol><li>Mescolare 200 mg di agarose di basso grado molecolare fluorescente con 20 mL di tampone Ca-HEPES (1% concentrazione di agarose finale) e sciogliere l'agarose in un forno a microonde. Il lotto può essere riutilizzato più volte dopo che si solidifica, quindi è sufficiente ripetere la fase di riscaldamento.</li>
	<li>Versare 3 mL di agarose fuso in un piatto con fondo di vetro da 35 mm(Tabella dei materiali). Lasciare che l'agarose si solidifichino.</li>
	<li>Utilizzando una micro-spatola di laboratorio, rimuovere con cura il cuscinetto di agarose dal piatto da 35 mm senza disturbare il palo centrale del pad di agarose. Capovolgere il lato inferiore del pad rivolto verso l'alto e posizionarlo in una copertura del piatto Petri (Figura 2).</li>
	<li>Mettere 5 L di sospensione concentrata E. coli sulla parte superiore del pad capovolto e diffondere le cellule nel polo centrale utilizzando un loop di inoculazione. Aggiungere 5 L di sospensione concentrata B. bacteriovorus (OD600 di 0,2 USD) sulla superficie rivestita di E. coli. Non spargere le cellule.</li>
	<li>Riportare rapidamente il gel di agarose al piatto con fondo di vetro da 35 mm (lato superiore rivolto verso il basso), quindi coprire con un coperchio. Se necessario, rimuovere eventuali bolle d'aria premendo delicatamente l'agar contro la piastra.</li>
</ol><img alt="Schema di configurazione dell'esperimento batterico; Piastra di Petri, E. coli, B. bacteriovorus, microscopio invertito." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. Il cuscinetto di agarose viene rimosso dal piatto da 35 mm e capovolto in modo che il lato inferiore si affaccia verso l'alto. Sospensioni fresche di cellule predatorie e coltura durante la notte di cellule preda sono poste sul pad capovolto per rivestire il lato "inferiore". Il pad di agarose viene quindi capovolto al suo orientamento originale e riposto nella piatto da 35 mm, che viene montato sullo stadio del microscopio invertito nella camera al microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig02large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
5. Conduzione della microscopia a fluorescenza time-lapse
<ol><li>Mettere il piatto da 35 mm nel portapiacchi Petri in modo che non si muova nel corso dell'esperimento. Posizionare una goccia di olio di immersione (1.518 indice di rifrazione) sull'obiettivo e sul fondo della piatto da 35 mm.</li>
	<li>Montare il supporto sul palco del microscopio invertito nella camera al microscopio.</li>
	<li>Impostare le opzioni nel software di controllo al microscopio per raccogliere più immagini in più posizioni di fase nel tempo.<ol>
<li>Impostare l'ingrandimento (100x) e la lente policromica (GFP/mCherry). Utilizzando un pezzo occhio e un campo luminoso (BF), trovare il piano focale e aprire il gestore della lista dei punti.</li>
		<li>Selezionare almeno 10 posizioni di interesse spostando lo stage e memorizzando le coordinate per ogni posizione nel software al microscopio facendo clic sul pulsante Segna punto. Evitare le posizioni situate vicine l'una all'altra per evitare fotobleaching e fototossicità. Ruotare la valvola della fotocamera dall'oculare al monitor e calibrare ogni punto impostando il piano focale e facendo clic sul pulsante Sostituisci punto nel gestore dell'elenco dei punti.</li>
		<li>Aprire la finestra di progettazione dell'esperimento e impostare tutti i parametri sperimentali in ogni scheda come segue:<ol>
<li>Deselezionare la casella di sovrapposizione.</li>
			<li>Scegliere i canali fluorescenti e impostare le impostazioni di illuminazione ottimali. In questo caso, sono state utilizzate le seguenti impostazioni: per il canale mCherry, set di filtri mCherry (EX575/25; EM625/45), intensità del 50% e tempo di esposizione di 200 ms; per il canale GFP, set di filtri GFP (EX475/28; EM525/48), intensità del 50% e 80 ms; e per le immagini BF, il canale POL, l'intensità del 5% e 50 ms.</li>
			<li>Selezionare gli intervalli tra l'acquisizione di immagini e il tempo totale dell'esperimento. Qui, sono stati eseguiti intervalli di 5 minuti nel periodo di 10 ore dell'esperimento.</li>
			<li>Abilitare la manutenzione dello stato attivo per le posizioni scelte (per il sistema utilizzato qui, selezionando la casella di controllo Mantieni lo stato attivo con UltimateFocus).</li>
			<li>Selezionare la cartella dati in cui salvare automaticamente i file di immagine.</li>
			<li>Ricontrollare tutte le impostazioni nel controllo software al microscopio, quindi avviare l'esperimento time-lapse.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la prima ora dell'esperimento, verificare che tutte le posizioni di fase siano ancora a fuoco. Regolare la messa a fuoco durante gli intervalli di tempo tra l'acquisizione dell'immagine, se necessario.</li>
	<li>Quando l'esperimento time-lapse è finito, rimuovere la piastra Petri e utilizzare il piatto da 35 mm con un tampone di agarose secondo il protocollo di biosicuità. NOTA: tutti i passaggi secondari dopo il passaggio 5.2 sono specifici per gli utenti DeltaVision Elite. I ricercatori che utilizzano altri sistemi devono regolare le impostazioni in base ai singoli sistemi.</li>
</ol>6. Elaborazione di immagini time-lapse e generazione di film utilizzando il software Fiji
<ol><li>Trasferire dati sperimentali su un computer caricato con il software Fiji. Avviare il programma Fiji e aprire un'immagine utilizzando File Aprire o semplicemente trascinando e rilasciando il file di immagine in Fiji.</li>
	<li>In Opzioni di importazione bio-formatiscegliere Visualizza pila con Hyperstack nelle opzioni di visualizzazione della pila, fare clic sulla modalità Colore composito nelle opzioni di colore e contrassegnare Scala automatica.</li>
	<li>Scorrendo le pile di immagini, valutare se le celle e i bdelloplasts sono rimasti a fuoco nel corso dell'esperimento. Controllare se le macchie fluorescenti verdi di DnaN-mNeonGreen sono presenti all'interno delle cellule B. bacteriovorus all'interno di bdelloplasts durante la fase di crescita e assicurarsi che tutte le fasi del ciclo di vita predatorio possano essere visualizzate.</li>
	<li>Per analizzare una particolare cella B. bacteriovorus/bdelloplast, contrassegnarla utilizzando gli strumenti di selezione del menuFigi( Rettangolo , Ovale , Poligono o Mano libera). Duplicare l'area scelta utilizzando Immagine Duplicare o utilizzando D Ctrl .</li>
	<li>Regolare la luminosità e il contrasto per ogni canale di fluorescenza come segue:<ol>
<li>Per scegliere un singolo canale, aprite gli strumenti Canale facendo clic su Immagine . Proprietà Color . Strumenti Canali o Ctrl e Maiusc e selezionare il canale di interesse (Canale 1: mCherry, Canale 2: mNeonGreen, Canale 3: campo luminoso).</li>
		<li>Regolare la luminosità e il contrasto delle immagini nel canale di fluorescenza aprendo il menu B&amp;C in Immagine . Regolare la proprietà Luminosità/Contrasto o facendo clic su Ctrl e Maiusc . C</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiunta della barra della scala mediante Analizza Strumenti - Strumenti Barra della scala. Aggiungere l'indicatore di data e ora alle immagini facendo clic su Immagini . Proprietà Stacks . Indicatore di data e ora.</li>
	<li>Per salvare le immagini modificate, vai a File Salva con nome e scegli TIFF per salvare come sequenza di immagini, AVI per produrre un filmato o PNG per salvare una singola immagine del fotogramma corrente.</li>
</ol>

<ol><li>Shatzkes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predatory+Bacteria+Attenuate+Klebsiella+pneumoniae+Burden+in+Rat+Lungs%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs.</a> mBio. 7 (6), (2016).</li>
<li>Iebba, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bdellovibrio+bacteriovorus+directly+attacks+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+Cystic+fibrosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 5, (2014).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injections+of+Predatory+Bacteria+Work+Alongside+Host+Immune+Cells+to+Treat+Shigella+Infection+in+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae.</a> Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+flagellar+filament+and+the+role+of+motility+in+bacterial+prey-penetration+by+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).</li>
<li>Lambert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Predatory+Patchwork%3A+Membrane+and+Surface+Structures+of+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbial+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Chromosomal+Replication+in+Predatory+Bacterium+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).</li>
<li>Makowski, Ł, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Chromosome+Replication+and+Its+Relationship+to+Predatory+Attack+Lifestyles+in+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).</li>
<li>Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadowing+the+actions+of+a+predator%3A+backlit+fluorescent+microscopy+reveals+synchronous+nonbinary+septation+of+predatory+Bdellovibrio+inside+prey+and+exit+through+discrete+bdelloplast+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores.</a> Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+D-amino-acids+reveal+bi-cellular+cell+wall+modifications+important+for+Bdellovibrio+bacteriovorus+predation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation.</a> Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).</li>
<li>Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predation+of+human+pathogens+by+the+predatory+bacteria+Micavibrio+aeruginosavorus+and+Bdellovibrio+bacteriovorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus.</a> Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

A causa del crescente interesse per l'uso di B. bacteriovorus come antibiotico vivente, sono necessari nuovi strumenti per osservare il ciclo di vita predatorio, in particolare le interazioni predatore-patogeno. Il protocollo presentato viene utilizzato per tracciare l'intero ciclo di vita B. bacteriovorus, soprattutto durante la sua crescita all'interno dell'host, in tempo reale. Inoltre, l'applicazione di un ceppo che produce morsetto beta fluorescente della polimerasi DEL DNA III holoenzyme ha permes...

Bdellovibrio bacteriovorus è un piccolo batterio gram-negativo che preda altri batteri gram-negativi, tra cui patogeni nocivi come Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Shigella flexneri1,2,3. Poiché B. bacteriovorus uccide agenti patogeni, è considerato un potenziale antibiotico vivente che può essere applicato per combattere le infezioni batteriche, in particolare quelle causate da ceppi multifarmacori.
B. bacteriovorus presenta un ciclo di vita particolare costituito da due fasi: una fase di attacco non replicativo e una fase riproduttiva intracellulare (Figura 1). Nella fase di vita libera, questo batterio altamente motile, che si muove a velocità fino a 160 m/s, cerca la sua preda. Dopo essersi attaccata alla membrana esterna della preda, entra nel periplasma4,5. Durante la fase riproduttiva interperiplasmica, B. bacteriovorus utilizza una pletora di enzimi idrolitici per degradare le macromolecole dell'ospite e riutilizzarle per la propria crescita. Poco dopo aver invaso il periplasma, la cellula ospite muore e si gonfia in una struttura sferica chiamata bdelloplast, all'interno della quale la cellula predatoria allunga e replica i suoi cromosomi. Il processo di replica inizia dall'origine della replica (oriC)6 e procede fino a quando diverse copie del cromosoma non sono state completamente sintetizzate7. È interessante notare che la replica di ogni cromosoma non è seguita dalla divisione cellulare. Invece, il predatore si allunga per formare una cellula lunga, multinucleoide e filamentosa. Al momento dell'esaurimento dei nutrienti, il filamento subisce setto sincrono e le cellule della progenie vengono rilasciate dal bdelloplast8.
Prima che B. bacteriovorus possa essere usato come antibiotico vivente contro le infezioni batteriche, è fondamentale comprendere le principali fasi del suo ciclo di vita, in particolare quelle legate alla sua proliferazione all'interno della preda. L'imaging a cellule vive di B. bacteriovorus è stato impegnativo, a causa delle varie forme morfologiche del predatore e della sua preda durante il complesso ciclo di vita. Finora, le interazioni tra B. bacteriovorus e la sua cellula ospite sono state studiate principalmente dalla microscopia elettronica e dall'analisi a scatto a scatto2,9,10, entrambe con limitazioni, soprattutto quando vengono utilizzate per monitorare le fasi successive del ciclo di vita predatorio. Questi metodi forniscono immagini ad alta risoluzione di cellule B. batteriovorus e consentono l'osservazione di un piccolo predatore durante la fase di attacco o di crescita. Tuttavia, non consentono il tracciamento di singole cellule B. batteriovorus durante entrambe le fasi del ciclo di vita.
Presentato qui è un protocollo completo per l'utilizzo di microscopia a fluorescenza time-lapse (TLFM) per monitorare l'intero ciclo di vita di B. bacteriovorus. Un sistema costituito da un cuscinetto di agarose viene utilizzato in combinazione con un piatto di imaging cellulare, in cui le cellule predatorie possono muoversi liberamente sotto il cuscinetto di agarose mentre le cellule preda immobilizzate sono in grado di formare bdelloplasts (Figura 2). Questo set-up è preparato sulla base di ceppi specifici di E. coli e B. bacteriovorus, ma il protocollo può essere facilmente modificato per adattarsi ai singoli ceppi di un utente (ad esempio, portando diversi marcatori di selezione, proteine fuse con fluorofori diversi, ecc.).
In questo caso, per visualizzare B. bacteriovorus durante la fase di attacco, è stato costruito un ceppo specifico (HD100 DnaN-mNeonGreen/Pil-mCherry) che esprime una versione fluorescente della proteina citoplasmica, Pil , (disponibile nel nostro laboratorio su richiesta)7. Questo ceppo produce inoltre DnaN (il morsetto β-sliding), una sottounità di oloenzima della polimerasi del DNA III, fusa con una proteina fluorescente. Ciò consente di monitorare la replicazione del DNA in corso all'interno delle cellule predatorie man mano che crescono all'interno dei bdelloplasts.
Sebbene il protocollo e il software descritti utilizzati per l'acquisizione delle immagini si riferis facciano riferimento a un microscopio invertito fornito da un produttore specifico (c'è la tabella dei materiali), questa tecnica può essere regolata per qualsiasi microscopio invertito dotato di camera ambientale o di un altro supporto di riscaldamento esterno e in grado di imaging time-lapse. Per l'analisi dei dati, gli utenti possono scegliere qualsiasi software disponibile compatibile con i singoli formati di output.
<img alt="Diagramma del ciclo di vita di Bdellovibrio; fasi di attacco e riproduttive; processo di invasione batterica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61105/61105fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: B. ciclo di vita batterivoro in E. coli come cella ospite. Durante la fase di attacco, una cellula B. bacteriovorus che nuota libera cerca e si attacca a una cellula E. coli ospitante. Dopo l'invasione, la cellula predatoria viene localizzata nel periplasma della preda, cambiando la forma della cellula ospite e formando un bdelloplast. La fase riproduttiva inizia con la formazione di bdelloplastica. La cellula predatoria digerisce la cellula preda e riutilizza semplici composti per costruire le proprie strutture. B. bacteriovorus cresce come un lungo filamento singolo all'interno del periplasma dell'ospite. Quando le risorse della cellula preda sono esaurite, il filamento B. bacteriovorus si setta in modo sincrono e forma cellule progenie. Dopo che le cellule della progenie sviluppano i loro flagelli, elivano il bdelloplast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61105/61105fig01large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Centrifuga</td><td>MPW MED. INSTRUMENTS</td><td>MPW-260R</td><td>Rotore ref. 12183</td></tr><tr><td>Certificato Biologia molecolare Agarosio</td><td>BIO-RAD</td><td>161-3100</td><td>agarosio a bassa fluorescenza per tampone di agarosio</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>Pacchetto di elaborazione delle immagini open source</td></tr><tr><td>Piatto inferiore in vetro 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81218-200</td><td>vetro</td></tr> <tr><td>non rivestitoMicroscopio</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Microtiter Stage, modulo laser di messa a fuoco ultima, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, assemblaggio SSI FP DV, kit obj. Oly 100x olio 1.4 NA, prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V</td></tr><tr><td>Minisart Filter 0.45 &; m</td><td>Sartorius</td><td>16555----------K</td><td>Acetato di cellulosa, sterile, Luer Lock Uscita</td></tr><tr><td>Start SoftWoRx</td><td>GE</td><td></td><td>Software di imaging fornito dal produttore</td></tr></tbody></table>

imaging a cellule vive del ciclo di vita del predatore batterico bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus è un piccolo batterio predatorio negativo e obbligato che uccide altri batteri gram-negativi, compresi gli agenti patogeni nocivi. Pertanto, è considerato un antibiotico vivente. Per applicare B. bacteriovorus come antibiotico vivente, è prima necessario comprendere le principali fasi del suo complesso ciclo di vita, in particolare la sua proliferazione all'interno della preda. Finora, è stato difficile monitorare le fasi successive del ciclo di vita predatorio in tempo reale. Presentato qui è un protocollo completo per l'imaging in tempo reale dell'intero ciclo di vita di B. bacteriovorus, soprattutto durante la sua crescita all'interno dell'host. A tale scopo, viene utilizzato un sistema costituito da un cuscinetto di agarose in combinazione con piatti di imaging cellulare, in cui le cellule predatorie possono muoversi liberamente sotto il cuscinetto di agarose mentre le cellule di preda immobilizzate sono in grado di formare bdelloplasts. L'applicazione di un ceppo che produce una β-sottounità di polimerasi del DNA III consente inoltre di monitorare la replicazione cromosomia durante la fase di riproduzione del ciclo di vita B. batteriovorus.

Il sistema basato su TLFM descritto consente di tenere traccia in tempoFigure 3delle singole Movie 1cellule di B. La fusione Pil-mCherry consente di etichettare l'intera cellula predatoria nella fase di attacco e nella fase iniziale della fase di crescita (Figura 3). Il passaggio dall'attacco alla fase replicativa è stato presentato non solo dalla formazione bdelloplast ospite, ma anche dalla comparsa del replisome (macchina di replica)...

Qui è presentato un protocollo che descrive il monitoraggio dell'intero ciclo di vita del batterio predatorio Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse in combinazione con un cuscinetto di agarose e piatti di imaging cellulare.

Imaging a cellule vive del ciclo di vita del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza Time-Lapse

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

L'imaging batteriovoro Bdellovibrio a cellule vive è stato impegnativo a causa del complesso ciclo di vita di questi batteri predatori. Il nostro protocollo consente il monitoraggio delle fasi del ciclo di vita completo in tempo reale. Sebbene il nostro protocollo si basi su uno specifico ceppi di equalizzazione, può essere facilmente adattato a una varietà di ceppi batterici tra cui ceppi patogeni.Per impostare una coltura di B.bacteriovorus, combinare un millilitro di batteri freschi coltivati 24 ore su 24 con tre millilitri di coltura di prede durante la notte in un matraccio da 250 millilitri contenente 50 millilitri di tampone di hippy di calcio integrati con antibiotici se necessario. Dopo un'incubazione di 24 ore a 30 gradi Celsius e 200 giri al minuto, verificare che le cellule preda siano state completamente lisci dalla microscopia a contrasto facciale montata sul liquido. Devono essere presenti numerose cellule B.bacteriovorus in fase multi-attacco e nessuna cellula E.coli o bdelloplast dovrebbe essere visibile.Filtrare la coltura di B.bacteriovorus attraverso un filtro di dimensioni dei pori di 0,45 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e sospendere il filtrato in una centrifuga. Quindi sospendere di nuovo il pellet di B.bacteriovorus in tre millilitri di hippy di calcio tamponare a una densità ottica finale a 600 nanometri di circa 0,2 e incubare i batteri a 30 gradi celsius e 200 giri al minuto per 30 minuti. Per preparare le cellule ospiti, selezionare una singola colonia dal ceppo ospite di interesse e nodulare i batteri in 10 millilitri di mezzo YT integrati con antibiotici se necessario per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 180 giri al minuto.La mattina seguente trasferire due millilitri della coltura notturna in una provetta da due millilitri e pelletare le cellule per centrifugazione. Quindi sospendere di nuovo il pellet in 200 microlitri di tamponamento hippy di calcio. È molto importante sospendere completamente l'intero pellet cellulare dopo la centrifugazione per assicurarsi che la cellula preda sia separata a livello di singola cella.Per preparare le cellule alla microscopia a fluorescenza time-lapse, in primo luogo, mescolare 200 milligrammi di agarosio a basso grado molecolare fluorescente con 20 millilitri di tamponamento hippy di calcio e sciogliere l'agarosio in un forno a microonde. Versare tre millilitri dell'agarosio fuso in un piatto inferiore di vetro da 35 millimetri e lasciare che l'agarosio si solidifichi. Utilizzando una micro spatola da laboratorio, rimuovere con cura il tampone di agarosio dal piatto senza disturbare il palo centrale del pad e posizionare il lato inferiore del pad verso l'alto su una copertura della piastra di Petri.Posizionare cinque microlitri della sospensione della cella ospite concentrata sul pad capovolto e utilizzare un ciclo di inoculazione per diffondere le cellule nel polo centrale. Aggiungere quindi cinque microlitri della sospensione B.bacteriovorus concentrata sulla superficie rivestita della cellula ospite senza diffondersi e riportare rapidamente il gel al piatto inferiore inferiore in vetro da 35 millilitri dall'alto verso il basso. Quindi coprire il piatto con un coperchio.Per la microscopia Time-Lapse Florescence della co-coltura, mettere la piastra in un portapiatti di Petri in modo che la piastra non si muova nel corso dell'esperimento e posizionare una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo del microscopio invertito e una goccia sul fondo del piatto. Montare il supporto sullo stadio del microscopio all'interno della camera del microscopio invertito e nel software del microscopio impostare l'ingrandimento su 100X e la lente policroma su GFP e Mcherry. Utilizzando un iPS in Brightfield, individuate il piano focale e aprite l'inutile manager.Spostare la fase e utilizzare il pulsante contrassegni per memorizzare le coordinate di almeno 10 posizioni di interesse. Passare dall'iPS al monitor. Impostare il piano focale e fare clic sul pulsante sostituisci punto inutile da gestore per calibrare ogni punto.Aprire il progettista dell'esperimento e deselezionare la casella di impilamento delle malattie. Selezionare i canali fluorescenti appropriati e le impostazioni di eliminazione ottimali e impostare gli intervalli tra l'acquisizione dell'immagine e il tempo totale dell'esperimento. Abilitare la manutenzione dello stato attivo per le posizioni scelte e selezionare la cartella dati in cui i file di immagine devono essere salvati automaticamente.Ricontrollare tutte le impostazioni nel controllo software del microscopio e avviare l'esperimento time-lapse. Dopo la prima ora dell'esperimento, verificare che tutte le posizioni dello stadio siano ancora a fuoco. Al termine dell'esperimento time-lapse, rimuovere la piastra di Petri e scartare la piastra da 35 millimetri con un tampone di agarosio secondo gli opportuni protocolli di biosicurezza.Per l'elaborazione dei dati delle immagini time-lapse, trasferire i dati sperimentali su un computer caricato con il software Fiji e aprire un'immagine nelle Figi. Nelle opzioni di importazione dei biosi formati selezionare stack di visualizzazione con hyperstack. In modalità colore composito, selezionare scala automatica.Scorrendo gli stack di immagini si valuta se le cellule e i bdelloplasti sono rimasti a fuoco nel corso dell'esperimento. Se le macchie fluorescenti verdi del DNA e del verde mNeon sono presenti all'interno delle cellule B.bacteriovorus all'interno dei bdelloplasti durante tutta la fase di crescita e se tutte le fasi del ciclo di vita predatorio possono essere visualizzate. Per analizzare un particolare bdelloplasto cellulare B.bacteriovorus, utilizzare uno strumento di selezione per contrassegnare la cellula di interesse.Quindi duplicare l'area scelta. Nell'immagine duplicata, fai clic su processo e smussa e per ogni canale fluorescente fai clic su immagine, colore, strumenti canali e seleziona il canale di interesse. Quindi fare clic su immagine, regolazione e contrasto della luminosità per regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine in ogni canale.Per aggiungere una barra di scala, selezionare analizza, strumenti e barra di scala. Per aggiungere un timestamp alle immagini, fare clic su immagini, stack e timestamp. Per salvare le immagini modificate, selezionare TIF.Per salvare i dati come sequenza di immagini, AVI per produrre un filmato o PNG per salvare una singola immagine del fotogramma corrente. Questo sistema basato sulla microscopia a fluorescenza time-lapse consente il tracciamento in tempo reale delle singole cellule B.bacteriovorus e fornisce preziose informazioni su ogni fase del complesso ciclo di vita predatorio. La fusione gogna mCherry consente di etichettare l'intera cellula predatoria nella fase di attacco e nella fase iniziale della fase di crescita.Il passaggio dall'attacco alla fase replicativa può essere visualizzato non solo dalla formazione ospite di bdelloplast ma anche dalla comparsa del replisome. Il replisome viene assemblato al polo cellulare invasore e più di un replisome può essere osservato all'interno di un filamento B.bacteriovorus in crescita man mano che la fase di riproduzione progredisce. Dopo che diverse copie del cromosoma sono state sintetizzati, la replicazione viene terminata.Infine, il filamento multinucleato subisce settazione e le cellule di progenie vengono rilasciate dal bdelloplasto. Le cellule B.bacteriovorus dovrebbero essere abbastanza materiali da cercare attivamente la loro preda e l'intera densità cellulare dovrebbe essere abbastanza alta da consentire l'attacco cellulare predatorio. Questa piattaforma può essere utile in esperimenti che coinvolgono agenti patogeni resistenti a più farmaci e per facilitare il miglioramento dell'ingegneria genetica del batteriovoro B come antibiotico vivo nella medicina umana e veterinaria.

live-cell-imaging-life-cycle-bacterial-predator-bdellovibrio

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui mostriamo i protocolli per l'esecuzione di singola molecola microscopia a fluorescenza a vivere cellule batteriche per permettere funzionali complessi molecolari per essere rilevati, monitorati e quantificati.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Questo protocollo offre un passo-passo procedura per monitorare il comportamento singola cellula dei batteri diversi nel tempo con modalità automatizzate fluorescenza microscopia time-lapse. Inoltre, forniamo le linee guida su come analizzare le immagini di microscopia.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

In questo articolo viene descritta la procedura per la preparazione di una versione fluorescente marcato del batteriofago lambda, infezione...

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

Fonte: Heering, J., et al., Induzione della differenziazione cellulare e imaging di singole cellule di Vibrio parahaemolyticus Swimmer e Swarmer. J. Vis. Exp. (2017).Questo video mostra la preparazione di cellule swarmer da una colonia di Vibrio parahaemolyticus per l'imaging a fluorescenza. I batteri sono geneticamente modificati per esprimere una proteina marcata con fluorofori che si localizza unipolarmente nelle cellule nuotatrici e bipolarmente nelle cellule a sciame allungate, consentendo...

Preparazione delle cellule Swarmer di Vibrio parahaemolyticus per l'imaging

Fonte: Schumacher, D., e Sogaard-Andersen, L. Imaging a fluorescenza delle cellule vive dell'intero ciclo cellulare vegetativo del batterio sociale a lenta crescita Myxococcus xanthus. J. Vis. Esp. (2018)Questo video dimostra l'uso dell'imaging delle cellule vive per tracciare le origini cromosomiche marcate con fluorescente durante la divisione cellulare batterica. Cattura la dinamica della segregazione cromosomica utilizzando microscopia a contrasto di fase a tempo e fluorescenza.

Imaging a time-lapse della segregazione cromosomica in batteri marcati con fluorescenza

Fonte: Makowski, Ł., et al. Imaging con cellule vive del ciclo vitale del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza a tempo indeterminato. J. Vis. Esp. (2020)Questo video dimostra l'imaging a fluorescenza in time-lapse di Bdellovibrio bacteriovorus che preda E. coli immobilizzata sotto un cuscinetto di agarosio, permettendo la visualizzazione in tempo reale della replicazione intracellulare e del rilascio dei discendenti per studiare la predazione...

Imaging time-lapse di cellule vive della predazione di Bdellovibrio bacteriovorus su E. coli

Fonte: Brzozowski, R. S. et al. Microscopia a fluorescenza a cellule vive per indagare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti morfologici cellulari nei batteri. J. Vis. Esp. (2019)Questo video dimostra la microscopia a fluorescenza a cellule vive per visualizzare cambiamenti morfologici in tempo reale nei batteri. Descrive i passaggi coinvolti nell'imaging, nell'acquisizione del time-lapse e nella deconvoluzione per ottenere immagini ad alta risoluzione in tempo reale.

Imaging dei cambiamenti morfologici nei batteri utilizzando la microscopia a fluorescenza a cellule vive

Gli streptomici sono caratterizzati da un ciclo di vita complesso che è stato difficile da studiare sperimentalmente con mezzi biologici cellulari. Qui presentiamo un protocollo per eseguire la microscopia time-lapse a fluorescenza dell'intero ciclo di vita coltivando Streptomyces venezuelae in un dispositivo microfluidico.

Fluorescenza Time-lapse imaging del Complete<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Ciclo di vita Uso di un dispositivo a microfluidi

Capire la funzione dei processi essenziali nei batteri è complesso. Microscopia a fluorescenza con target-specifici coloranti possa fornire spunti preziosi per progressione di crescita e ciclo cellulare delle cellule microbiche. Qui, Agrobacterium tumefaciens è usato come un batterio modello per evidenziare i metodi per l'imaging di cellule vive per la caratterizzazione dei processi essenziali.

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

Le cellule batteriche sono spazialmente altamente organizzate. Per seguire questa organizzazione nel corso del tempo in lenta crescita xanthus di Myxococcus cellule, è stato sviluppato un set-up per l'imaging di cellule vive di fluorescenza ad alta risoluzione spazio-temporale sopra parecchie generazioni. Utilizzando questo metodo, potrebbe essere determinato spatiotemporal dinamica di proteine importanti per la segregazione del cromosoma e la divisione cellulare.

Imaging di fluorescenza Live-cella del completo ciclo cellulare vegetativo della lenta crescita sociale batterio xanthus di Myxococcus

Questo articolo fornisce una guida passo-passo per studiare le dinamiche di localizzazione subcellulare delle proteine e per monitorare i cambiamenti morfologici utilizzando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

Scopri come monitorare il ciclo di vita completo di Bdellovibrio bacteriovorus mediante microscopia a fluorescenza time-lapse. Questo protocollo consente l'osservazione in tempo reale delle interazioni predatore-preda.

Imaging a cellule vive del ciclo di vita del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza Time-Lapse (Video) | JoVE Journal

Imaging a cellule vive del ciclo di vita del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza Time-Lapse

Esplora altri video