Instillazione intratracheale delle cellule staminali nei " ratti neooatali

Descritto è un protocollo per eseguire il trapianto intratracheale di cellule stromali mesenchymale (MSC) attraverso l'iniezione intratracheale in ratti neonatici. Questa tecnica è un'opzione clinicamente praticabile per la somministrazione di cellule staminali e farmaci nei polmoni di ratto neoatale per valutarne l'efficacia.

L'instillazione intratracheale è una biotecnologia clinica per la somministrazione di cellule staminali e farmaci in un polmone neonatale per valutare l'efficacia di Chilman. Questa tecnica può essere in buona fede per l'uso con una varietà di applicazione primaria in un ratto neonatale ed è una misura relativamente facile ed economica per il trattamento delle malattie polmonari. Il quinto giorno postnatale, trattenete i cuccioli di ratto Sprague-Dawley anestetizzati, su un supporto di intubazione angolato di 60 gradi.

E apporre nastro adesivo da laboratorio a tutti e quattro gli arti di ogni cucciolo per fissarli in posizione. Applicare il nastro sotto ogni naso per fissare le teste. E individuare il primo collo per la tracheotomia delle forature.

Utilizzare un tampone di preparazione alcolico al 75% per disinfettare l'area di incisione. E fare un'incisione verticale della linea mediana di 3 centimetri sopra la trachea per evitare di danneggiare le arterie carotidee. Utilizzare pinzette affusolata curve senza gancio per dissociare gli strati di grasso e muscoli per localizzare la trachea.

Quando la trachea può essere osservata, utilizzare le pinzette per afferrare la trachea e utilizzare una siringa da 100 microlitri dotata di un ago calibro 30 per iniettare una per dieci della quinta lucciola luciferasi GFP etichettata cellule stromali mesenchimali in 30 microlitri di saline nella trachea, durante la fase inspiratoria. Quando tutte le cellule sono state iniettate, chiudere l'incisione con 160 punti di seta legando il nodo il più strettamente possibile. E tagliare le estremità della sutura il più breve possibile.

Quindi consentire al cucciolo di riprendersi dall'anestesia, in un punto caldo con monitoraggio fino a quando non è caldo, rosa e capace di movimento spontaneo prima di riportare l'animale nella sua gabbia. Per rintracciare le cellule stromali mesenchimali umane trapiantate 15 minuti dopo che i ratti si sono ripresi dall'intervento chirurgico, iniettare intraperitonealmente i cuccioli riaestetizzati con 125 milligrammi per chilogrammo di sale di potassio luciferiano in PBS. 10 minuti dopo l'iniezione, utilizzare un piccolo sistema di imaging animale per acquisire immagini sequenziali a intervalli di 5-15 secondi con un binning medio, un 1 f-stop e un campo visivo di 26 centimetri.

Quindi utilizzare il software di imaging per quantificare l'attività di luminescenza dai polmoni in base alle regioni automatiche di interesse. Un alto livello di espressione della FPG è osservato nella lucciola luciferasi etichettata come cellule staminali mesenchimali umane. Le cellule staminali mesenchimali possono essere ulteriormente caratterizzate dalla loro espressione marcatore della superficie cellulare e dalla loro capacità di differenziarsi in osteociti, condrociti e adipociti.

L'imaging di luminescenza delle cellule mesenchimali umane trapiantate in VIVO rivela l'assenza di segnalazione luminescente nelle regioni polmonari dei ratti trattati con soluzione salina normale. Nei ratti trattati con cellule staminali mesenchimali, la luminescenza si osserva all'interno della trachea e delle regioni polmonari centrali di tali animali. In effetti, in questa analisi rappresentativa, la quantificazione dell'intensità della luminescenza ha rivelato che i ratti trattati con cellule staminali mesenchimali presentavano un aumento di circa 13 volte dell'attività di luminescenza rispetto ai ratti trattati con soluzione salina normale.

Quando si tenta questa procedura, è importante sezionare e isolare la trachea senza limitare le arterie circostanti. Questa tecnica consente lo studio degli effetti della somministrazione intratracheale di cellule e farmaci della malattia neonatale palmer usando raggi con la modalità del paziente umano.