Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici
16 maggio 2020
Questo protocollo illustra 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità del saccarosio seguito da analisi western blot.
Il vantaggio dell'utilizzo della centrifugazione differenziale per questo protocollo è che è facilmente scalabile fino a litri e quindi ideale per isolare gli esosomi dai fibroblasti primari. Gli esosomi purificati possono essere ottenuti da diversi tipi di cellule e tessuti isolati da vari modelli di malattia. Gli esosomi possono essere utilizzati come biomarcatori diagnostici.
A dimostrare questa procedura sarà Diantha van de Vlekkert, scienziata del Laboratorio d'Azzo Per iniziare, pesare i muscoli del topo e poi trasferirli in un piatto di 10 centimetri. Lavorando sotto una cappa di biosicurezza, tritare i muscoli con i bisturi per produrre una pasta fine. Trasferire la pasta di muscolo tritata finemente in una provetta da 50 millilitri e aggiungere la soluzione digestiva utilizzando 3,5 volte il volume per milligrammo di tessuto.
Incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius. Per favorire la completa dissociazione, miscelare accuratamente la sospensione con una pipetta da 5 millilitri ogni 10 minuti. Per inattivare la soluzione digestiva, aggiungere 20 millilitri di DMEM Complete alla sospensione cellulare.
Pipettare attraverso un colino cellulare in nylon da 70 micrometri posizionato su una provetta da 50 millilitri, quindi lavare il filtro cellulare con altri 5 millilitri di DMEM Complete. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM Complete.
Semina le cellule in un piatto di 10 centimetri, quindi posiziona il piatto nell'incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 3% di ossigeno. Le colture di fibroblasti del muscolo scheletrico devono essere mantenute a un basso livello di ossigeno per garantire condizioni di luce fisiologiche. Il livello di ossigeno nel muscolo scheletrico è di circa il 2,5%Dopo che le cellule hanno raggiunto il 100% di confluenza, coltivarle per un giorno aggiuntivo, quindi sciacquarle con PBS e aggiungere un millilitro di soluzione di tripsinizzazione.
Dopo aver incubato le cellule per 10 minuti, interrompere la tripsinizzazione aggiungendo 10 millilitri di DMEM Complete. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 millilitri, quindi centrifugare le cellule a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi risospendere il pellet in 20 millilitri di DMEM completo e seminare le cellule in un piatto di 15 centimetri.
Raccogliere il terreno condizionato dai fibroblasti in coltura in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare il terreno condizionato a 300 g per 10 minuti per pellettare le cellule vive. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 millilitri e pellettare le cellule morte centrifugando la provetta a 2.000 g per 10 minuti.
Quindi, trasferire il surnatante in una provetta di polipropilene da 38,5 millilitri e centrifugare la provetta a 10.000 g per 30 minuti per rimuovere organelli, corpi apoptotici e frammenti di membrana. Per pellettare gli esosomi, trasferire il surnatante in una provetta ultratrasparente da 38,5 millilitri e centrifugarlo a 100.000 g per 1,5 ore. Scartare con cura il surnatante, lasciando circa un millilitro di terreno condizionato.
Lavare il pellet di esosoma e ri-sospenderlo in un massimo di 30 millilitri di PBS ghiacciato. Centrifugare nuovamente gli esosomi a 100.000 g per 1,5 ore. Per completare la purificazione, rimuovere il surnatante mediante pipettaggio, facendo attenzione a non disturbare il pellet esosomiale.
Il passaggio del pellet dell'esosoma può essere allentato e facilmente staccabile. Pertanto, la rimozione del surnatante PBS deve essere eseguita con molta attenzione con l'aiuto di una pipetta da 200 microlitri. Risospendere il pellet in PBS ghiacciato utilizzando 25 microlitri per piatto di 15 centimetri di fibroblasti.
Infine, misurare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA e un lettore di micropiastre a 562 nanometri. Questo protocollo è un metodo altamente riproducibile e coerente per la purificazione degli esosomi. La microscopia elettronica a trasmissione mostra le dimensioni relativamente uniformi di questi esosomi.
L'immunoblot dei lisati esosomici mostra un pattern canonico di espressione proteica e l'assenza di contaminanti proteici LDH e calnexina. Gli esosomi sono stati separati da un gradiente di densità del saccarosio e le singole frazioni sono state sondate su un western blot con anticorpi contro Alix, CD9 e CD81. Gli esosomi si sedimentavano costantemente nelle frazioni da tre a sei.
Gli esosomi bioattivi isolati e concentrati possono essere utilizzati per analisi di microscopia elettronica e spettrometria di massa, nonché per esperimenti di captazione in vitro e in vivo per studi funzionali. Questo protocollo è adatto per l'isolamento di esosomi da cellule a bassa secrezione e può essere applicato per esplorare il coinvolgimento degli esosomi nelle malattie fibrotiche umane.
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Panoramica
Questo protocollo illustra l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e la purificazione e caratterizzazione di esosomi mediante un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità al saccarosio, seguito da analisi di western blot. La capacità di isolare esosomi da fibroblasti primari rende questo metodo significativo per lo studio del loro potenziale come biomarcatori diagnostici.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Ricerca sugli esosomi
- Malattie fibrotiche
Contesto
- L'isolamento di fibroblasti primari fornisce informazioni sui meccanismi cellulari.
- Gli esosomi svolgono un ruolo fondamentale nella comunicazione cellulare e possono fungere da biomarcatori di malattia.
- La tecnica consente l'isolamento scalabile di esosomi da diversi tessuti.
Metodi Utilizzati
- Ultracentrifugazione differenziale per la purificazione degli esosomi
- Muscolo gastrocnemio del topo come sistema biologico
- Analisi mediante blotting Western per la caratterizzazione
Risultati principali
- Isolati e caratterizzati con successo gli esosomi dai fibroblasti.
- Osservato un pattern di sedimentazione costante degli esosomi attraverso gradienti di saccarosio.
- Dimostrata l'assenza di contaminanti proteici negli esosomi purificati.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un metodo riproducibile per l'isolamento di esosomi che potrebbe contribuire alla comprensione delle malattie fibrotiche.
- I risultati evidenziano le potenziali applicazioni terapeutiche degli esosomi nella diagnostica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici primari consente una produzione scalabile di vescicole extracellulari per la scoperta di biomarcatori e studi funzionali in modelli di malattie fibrotiche. Il protocollo supporta una purificazione riproducibile mediante centrifugazione differenziale e gradienti di densità al saccarosio, facilitando applicazioni successive come la spettrometria di massa e la microscopia elettronica. Questo approccio migliora la validazione degli obiettivi fornendo una fonte costante di esosomi bioattivi per la riduzione del rischio meccanicistico nella ricerca preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi del contenuto degli esosomi derivati dai fibroblasti per chiarire i meccanismi di segnalazione paracrina nell'omeostasi tissutale e nella fibrosi.
- Valore operativo: Fornisce un metodo scalabile per isolare gli esosomi da cellule primarie, favorendo un approvvigionamento costante per l'analisi dei percorsi target.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Gli esosomi purificati forniscono profili quantitativi di proteine e lipidi adatti alla standardizzazione dei saggi e allo sviluppo di pannelli di biomarcatori.
- Valore operativo: Il metodo consente l'elaborazione di volumi elevati, permettendo lo screening ad alto rendimento del carico associato agli esosomi in diverse condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Gli esosomi isolati da fibroblasti rilevanti per la malattia supportano l'allineamento traslazionale dei biomarcatori e la validazione funzionale preclinica.
- Valore operativo: L'adattabilità del protocollo a diversi tessuti e fluidi facilita la continuità tra modelli negli studi di de-risking degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla biologia iniziale del bersaglio alla validazione preclinica, in particolare per studi che coinvolgono la comunicazione tra cellule stromali e il segnale mediato da vescicole extracellulari.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui ruoli degli esosomi dei fibroblasti nella progressione della fibrosi e nella segnalazione intercellulare.
- Screening: Permette la preparazione standardizzata di campioni di esosomi per l'analisi comparativa della composizione del carico in condizioni diverse.
- Analisi: Genera campioni pronti per blotting Western, microscopia elettronica e spettrometria di massa per una caratterizzazione multi-omica.
- Ricerca traslazionale: Collega l'isolamento degli esosomi dei fibroblasti a modelli preclinici di malattie fibrotiche attraverso una produzione di vescicole costante e scalabile.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo è adattabile a diversi tipi cellulari e tessuti, posizionandolo come una piattaforma riutilizzabile per programmi di biomarcatori basati sugli esosomi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del bersaglio riducendo la variabilità nella purezza e nel rendimento degli esosomi.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso passaggi standardizzati di centrifugazione e purificazione su gradiente.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo candidati biomarcatori affidabili da fonti cellulari meccanicamente rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Permette una prioritizzazione adeguata ai rischi delle vie diagnostiche o terapeutiche basate sugli esosomi, sulla base di dati funzionali costanti.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare primaria, nell'ultracentrifugazione e nelle tecniche di western blot.
- È subordinato all'accesso a strumentazione per ultracentrifugazione e alla capacità di preparare gradienti di saccarosio.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per una valutazione coerente del rendimento e della purezza degli esosomi.
- L'adattamento a modelli di tessuti umani o malati potrebbe richiedere un'ottimizzazione delle condizioni di digestione e di coltura.
- I limiti pratici includono la possibile co-isolazione di aggregati proteici se i passaggi del gradiente non vengono eseguiti con attenzione.
