Name: Analisi della spettrometria di massa per identificare lubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Scopri l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione di CENP-A con tag EYFP. Questo metodo rivela siti di modificazione post-traduzionali essenziali per la funzione del centromero e la vitalità cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Chao-Jun Li presso il Model Animal Research Center della Nanjing University per l'analisi della spettrometria di massa. Ringraziamo Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa e gli attuali ricercatori del Model Animal Research Center, della Nanjing University e del Greehey Children's Cancer Research Institute per la loro utile discussione, guida sperimentale e reagenti. Ringraziamo Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago e Dawn S. Chandler per i loro generosi doni di reagenti. Y.N. è stato sostenuto dal Fondo di costruzione della provincia di Jiangsu ''Doppia-Prima Classe'', Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Provincia di Jiangsu 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Provincia "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) e National Natural Science Foundation in Cina (31970665). Questo studio è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione NCI R21 CA205659.

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Qui abbiamo descritto i metodi di analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che il tagging EYFP induce l'ubiquilazione in una diversa lisina nella proteina mutante CENP-A K124R8. Nei nostri risultati, abbiamo identificato con successo l'ubiquilazione sulla lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, che corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A attraverso l'analisi della spettrometria di massa. L'analisi della spettrometria di mass...

Nella maggior parte degli eucarioti, i microtubuli del mandrino devono essere attaccati a una singola regione di ogni cromosoma, definito centromero. Il cinetochore è un complesso di proteine che si trovano al centromero. Lo studio dei tempi dei movimenti della proteina centromera e cinetochore e la struttura dei cinetocori e dei centrimeri è importante per comprendere l'instabilità cromosomica (CIN) e la progressione del cancro. Le domande chiave sono come vengono determinate la posizione cromosomica e la funzione di un centromero (cioè l'identità del centromero) e come partecipano alla segregazione cromosomica accurata. Nella maggior parte delle specie, la presenza di un nucleomatoma speciale contenente una proteina simile a un istone specifica chiamata CENP-A definisce l'identità del centromero. Pertanto, si propone che il CENP-A sia l'indicatore non DNA (segno epigenetico) dell'identità del centromero. È importante chiarire il meccanismo di come CENP-A definisce l'identità del centromero negli esseri umani.
La proteina di riconoscimento della giunzione di Holliday (HJURP) è l'accompagnatore specifico CENP-A che deposita CENP-A nei nucleosomeri centromerici1,2,3. Abbiamo già riferito che il CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase è richiesto per l'ubiquilazione CENP-A sulla lisina 124 (K124) e la localizzazione del centromero4. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che il reclutamento di centrimeri di CENP-A di5nuova sintesi richiede CENP-A oniquizzato preesistente. Così, è stato fornito un modello che suggerisce che l'ubiquilinazione CENP-A viene ereditata attraverso la dimerizzazione tra le divisioni cellulari.
In contrasto con le nostre scoperte e quelle di Yu et al., risultati negativi per quanto riguarda il CENP-A e la sua localizzazione centromerica sono stati recentemente pubblicati6. L'articolo affermava che le modifiche del CENP-A sulla lisina 124 (K124) sono dispensabili per l'istituzione, la manutenzione e la funzione a lungo termine dei centrimeri umani, sulla base dei loro risultati negativi che mostravano che la mutazione di K124R non influenzava la localizzazione del centromero CENP-A né la vitalità cellulare6. Tuttavia, c'è abbastanza spazio per discutere nei loro risultati e conclusioni, e abbiamo già descritto quale problema ci potrebbe essere nella loro precedente pubblicazione7. Occorre prestare attenzione al fatto che fondessero le proteine con il CENP-A, che hanno pesi molecolari molto più grandi delle dimensioni del CENP-A endogeno: ad esempio, hanno fuso la proteina fluorescente gialla avanzata da 30 kDa (EYFP) a 16 kDa CE-A e hanno analizzato la fusione delle proteine EYFP-CENP-A K124R nel loro sistema RPE-1CE-A-Knockout.-/F L'ubiquitina K124 non dovrebbe legarsi direttamente all'HJURP sulla base di previsioni strutturali4, tuttavia si prevede che l'aggiunta di monoubiquitina avrà un impatto sulla conformazione proteica del CENP-A. La proteina della conformazione CENP-A può essere modificata dalla presenza di una grande proteina di fusione, e questo cambiamento conformazionale può mascherare i cambiamenti strutturali causati dalla perdita di ubiquilazione. Suggeriamo che la fusione di proteine di grandi dimensioni induca l'ubiquililazione in una lisina diversa da K124 nel mutante EYFP-CENP-A K124R e questa ubiquililazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante. La prova che l'ubiquilazione si verifica in lisina diversa nella proteina mutante CENP-A K124R con una grande proteina tag (EYFP) è stata riportata nella nostra precedente pubblicazione8. Si è scoperto che il tagging EYFP induce l'ubiquitinazione di un altro sito lisina di EYFP-CENP-A K124R e che EYFP-CENP-A K124R mutante lega a HJURP. Di conseguenza, questa ubiquilazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante, e sia EYFP-CENP-A WT che K124R mutanti hanno mostrato la localizzazione del centromero (abbiamo usato e confrontato pBabe-EYFP-CENP-A WT e K124R mutante, insieme al controllo pBabe-EFP). I risultati hanno dimostrato che i mutanti CENP-A K124R marcati con bandiera sono letali, ma possono essere salvati da una fusione monoubiquitina, suggerendo che l'ubiquilazione CENP-A è indispensabile per la vitalità cellulare.
Negli ultimi anni, molti studi hanno sviluppato diversi saggi per identificare le modifiche post-traduzionali (PTM) della proteina CENP-A e di altre proteine centromere-cinetochore sia in vivo che in vitro9,10,11. Analogo ai PTM delle proteine istone che sono un importante meccanismo che regola la funzione della cromatina, i PTM dei componenti della cromatina centromerici sono anche coinvolti in un meccanismo essenziale per regolare la struttura complessiva e la funzione dei centrimeri. La maggior parte dei siti CENP-A PTM sono specifici dei nucleosomi che contengono CENP-A, anche se alcuni di essi sono conservati nell'istone H3, suggerendo che la modifica di questi residui contribuisce alla funzione specifica del centromero. I PTM del CENP-A, tra cui il fosfororylazione, l'acetilazione, la metilazione e l'ubiquilazione sono stati precedentemente segnalati9, suggerendo che il CENP-A è sottoposto a una varietà di PTM e dei loro array combinatori sul suo dominio aminofileterminus e C-terminus histone-fold. L'importanza delle modifiche CENP-A in più funzioni è stata rivelata da molti gruppi, tra cui la nostra. Queste funzioni comportano la deposizione CENP-A ai centrimeri, la stabilità delle proteine e il reclutamento del CCAN (rete costitutiva associata a centrimere)9. Tuttavia, studi limitati e risultati dei PTM CENP-A sono preformati quando si fanno confronti con uno degli istoni canonici che regolano direttamente o indirettamente la loro funzione. Anche le relazioni tecniche che si concentrano sulla metodologia per identificare questi PTM CENP-A sono limitate.
Poiché l'ubiquilazione CENP-A è necessaria per la deposizione CENP-A alcentromero 12, ereditata dalla dimerizzazione tra la divisione cellulare5e indispensabile alla vitalità cellulare8, il metodo per identificare l'ubiquilazione CENP-A sarebbe essenziale in futuro per studiare l'attività funzionale, il posizionamento e la struttura del centromero. Pertanto, qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che il tagging EYFP induce l'ubiquilazione in una diversa lisina nella proteina mutante CENP-A K124R8. I protocolli di altri saggi e analisi di controllo (analisi dell'immunofluorescenza, analisi della crescita della colonia e analisi dell'ubiquilazione in vivo) sono anche presentati per discutere correttamente l'esito di un'analisi della spettrometria di massa maggiore.

<table><tbody><tr><td>Equpiments/Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml di proteine a basso legame</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>Per analisi di spettrometria di massa</td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare da 10 cm</td><td>BIOFIL/JET, Cina</td><td>700224</td><td>Piatto per coltura tissutale da 10 cm (Yohei lab, PN63)</td></tr><tr><td>Cluster per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>Coltura a 6 pozzetti piastra</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO-Concentratore</td><td></td> <td>sottovuoto da banco per peptidi secchi sottovuoto per analisi di spettrometria di massa</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &mu; m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>Colonna per cromatografia liquida (RPLC) per analisi di spettrometria di massa</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x lente ad immersione in olio</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X Lente ad immersione in olio</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x lente ad immersione in olio</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X Lente ad immersione in olio</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF Membrana di trasferimento</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza motorizzato Leica DM IRE2</td><td></td> <td>Microscopio a fluorescenza motorizzato</td><td>Leica</td></tr> <tr><td>EL6000 Sorgente luminosa compatta</td><td>Leica</td><td>Sorgente luminosa esterna per</td><td></td> eccitazione</tr><tr><td>fluorescente Vetro Micro Cover (22 mm x 22 mm)</td>Vetro di copertura <td>Surgipath</td><td>105</td><td>(22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel di poliacrilammide modello V16-2</td><td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td><td>31071010</td><td>Apparecchio per elettroforesi su gel I per applicare il gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>nanoLC.2D</td><td>Eksigent</td> <td>Technologies-sistema</td> <td>di cromatografia liquida per l'analisi della spettrometria di massa</td></tr><tr><td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0335BOX</td><td>I gel proteici Bis-Tris al 4%-12% disponibili in commercio per l'analisi</td></tr> <tr><td>della spettrometria di massaMicroscopio a scansione laser confocale Olympus FLUOVIEW FV3000</td><td></td> <td>Microscopio a scansione laser confocale Olympus-Confocal (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ download/#!dlOpen=%23detail847250519)</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Telecamera CCD Degital</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>Telecamera CCD</td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>Per una barriera idrorepellente nella colorazione immunofluorescente</td></tr><tr><td>TESSUTO PIASTRE PER COLTURE 10CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>Piastra per colture tissutali da 10 cm</td></tr><tr><td>Elettroforesi verticale per l'esecuzione di gel (grandi dimensioni)</td><td>Junyi, Cina</td><td>JY-SCZ6+</td><td>Apparecchio per elettroforesi su gel su gel II per applicare gel SDS-PAGE più grandi (Yohei lab, PE23)</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Frosted</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro vetrini</td></tr><tr><td>Anticorpi primari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Anticorpo monoclonale di topo</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CENP-B Novus</td><td>Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Anticorpo monoclonale di topo</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFP</td><td>ANTI #76 (anticorpo fatto in casa)</td><td></td><td>Anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>anti-HA (3F10)</td><td>Roche</td><td>11815016001</td><td>Anticorpo monoclonale di ratto</td></tr><tr><td>anti-HJURP</td><td>Proteintech Group</td><td>15283... 1-AP</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>anti-Ubiquitina</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-317A-1</td><td>Anticorpo policlonale di coniglio</td></tr><tr><td>Reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Reagente commerciale per il dosaggio delle proteine I per la misurazione della concentrazione proteica (compatibile con 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicatore</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Sonicatore Microtip Step, Solido, Filettato 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>Tromba disgregatrice per sonicazione</td></tr><tr><td>Sonicatore a ultrasuoni Branson Microtip Tapered 6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>Microtip per sonicazione</td></tr><tr><td>Tampone A1</td><td>-</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% desossicolato; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; reagente completo inibitore della proteasi senza</td></tr><tr><td>EDTA Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td>Reagente completo inibitore della proteasi senza EDTA per tampone A1</td></tr><tr><td>Coomassie blu brillante R-250</td><td>BBI Life Sciences</td><td>CAS 6104-59-2</td><td>Soluzione di blu di Coomassie per analisi di spettrometria di massa</td></tr><tr><td>Soluzione di cristallovioletto (2,3% di cristallovioletto, 0,1% di ossilato di ammonio, 20% di etanolo)</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>Per la colorazione delle colonie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Per la colorazione nucleare</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Medio</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM: F12</td></tr><tr><td>Siero fetale medio di bovino, certificato, calore inattivato, origine statunitense</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (siero fetale bovino)</td></tr><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio (Dulbecco' s Eagle modificato' Life</td> <td>Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Reagente di trasfezione I per trasfezione chimica</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, soluzione P3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Reagente di trasfezione II per trasfezione chimica</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Fissazione reagant</td></tr><tr><td>Latte magro in polvere (sostituto approvato del latte in polvere di garofano)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Riordino n. 190915; Lot# 90629)</td><td>Latte scremato scremato scremato</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Terreno sierico ridotto</td></tr><tr><td>p-fenilendiammina</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Per il montaggio medio</td></tr><tr><td>Penicillina, Streptomicina; Liquido</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicillina-streptomicina</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina SOLUZIONE</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poli-L-lisina, 0,1% p/v, in acqua</td></tr><tr><td>Polietilenimmina [PEI]; 1,0 mg/ml</td><td>Polysciences</td><td>23966&ndash; 2</td><td>Reagente di trasfezione III per trasfezione chimica</td></tr><tr><td>Perle di proteina A sefarosio CL-4B GE</td><td>Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td><td>Perle di proteina A sefarosio CL-4B per saggi di ubiquitinazione in vivo utilizzando pQCXIP-EYFP-CENP-A</td></tr><tr><td>Ripristina il tampone di strippaggio Western Blot</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>Western Blot Stripping Buffer I</td></tr><tr><td>Tripsina di grado di sequenziamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Per analisi di spettrometria di massa</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrato di massima sensibilità</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Substrato chemiluminescente potenziato (ECL) ultrasensibile</td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Acqua sterile per colture tissutali</td></tr><tr><td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoetanolo)</td><td>-</td><td>-</td><td>Western Blot Stripping Buffer II</td></tr><<tr><td>strong>Anticorpi secondari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>anticorpo secondario coniugato con fluorofori (anticorpo secondario purificato per affinità)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>anticorpo secondario coniugato con fluoroforo (anticorpo secondario purificato per affinità)</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW software</td><td>Olympus-Sofware</td><td></td> <td>C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>Analisi FV31S-DT software</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ download/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td><td>Olympus-Sofware</td><td></td> <td>C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td></tr><tr><td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td><td>LI-COR Biosciences-Software</td><td></td> D <td></td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>Imager a chemiluminescenza per la rilevazione di immunoblot</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Sistema di imaging a infrarossi</td><td>LI-COR Biosciences-Sistema</td><td></td> <td>di imaging a infrarossi per la rilevazione di immunoblot</td></tr><tr><td>Saftware OpenCFU -</td><td></td><td>-</td><td>Per il conteggio delle colonie (http://opencfu.sourceforge.net/)</td></tr><tr><td>Openlab versione 5.5.2. Software per imaging scientifico</td><td>Improvision/PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>A</td></tr><tr><td>ProteinPilot Software versione 4.5</td><td>AB SCIEX-Software</td><td></td> <td>F per analisi di spettrometria di massa</td></tr><tr><td>Quantità Uno Software di analisi 1D</td><td>Bio-Rad-Software</td><td></td> <td>E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ System</td><td>AB SCIEX-Strumento</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>per spettrometria di massaVolocity versione 6.3 Software di analisi delle immagini 3D (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B1</td></tr><tr><td>Volocity versione 6.3 Software di analisi delle immagini 3D (Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B2</td></tr></tbody></table>

analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del cenp-a con tag eyfp (eyfp-cenp-a)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studiare la struttura e la dinamica dei cinetocori e dei centrimeri è importante per comprendere l'instabilità cromosomica (CIN) e la progressione del cancro. Il modo in cui la posizione cromosomica e la funzione di un centromero (cioè l'identità del centromero) sono determinate e partecipano alla segregazione accurata del cromosoma è una questione fondamentale. Il CENP-A è proposto come l'indicatore non-DNA (segno epigenetico) dell'identità del centromero, e l'ubiquililazione CENP-A è necessaria per la deposizione CENP-A al centromero, ereditata dalla dimerizzazione tra divisione cellulare e indispensabile alla vitalità cellulare.
Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che l'ubiquilazione in una lisina diversa è indotta a causa dell'etichettatura EYFP nella proteina mutante CENP-A K124R. L'ubiquilità di lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R è stata identificata con successo, che corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A attraverso l'analisi della spettrometria di massa. Un avvertimento è discusso nell'uso di GFP/EYFP o l'etichettatura di proteine ad alto peso molecolare come strumento per analizzare la funzione di una proteina. L'attuale limite tecnico è discusso anche per l'individuazione di bande oniquilate, l'identificazione di ubiquilazione site-specific, e la visualizzazione dell'ubiquilazione nelle cellule viventi o una singola cellula specifica durante l'intero ciclo cellulare.
Il metodo di analisi della spettrometria di massa qui presentato può essere applicato alla proteina umana CENP-A con diversi tag e altre proteine del centromere-kinetochore. Questi metodi combinatori costituiti da diversi saggi / analisi potrebbero essere raccomandati per i ricercatori che sono interessati a identificare i ruoli funzionali dell'ubiquilazione.

Il mutante EYFP-CENP-A K124 mostra ubiquilazione, interazione con HJURP e nessun difetto nella localizzazione del centromere né la letalità cellulare. Qui il sistema riportato da Fachinetti et al. (2017)6 è stato ricostituito: in cellule umane diploide (RPE-1) che ne trasportavano una perturbata e un CENP-A ''floxed''(CENP-A-/F),-/FEYFP-CENP-A è stato espresso dal vettore retrò pBabe-EYFPvirus. In questo sistema, l'espressione del CENP-A endogeno dall'...

L'ubiquilazione CENP-A è un requisito importante per la deposizione ceNP-A al centromero, ereditata attraverso la dimerizzazione tra la divisione cellulare e indispensabile per la vitalità cellulare. Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione della proteina CENP-A (EYFP-CENP-A) marcata con EYFP.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Questo metodo consente di identificare l'ubiquità della proteina CENP-A taggata dall'EYFP. Può anche essere applicato alla proteina CENP-A umana con diversi test e altre proteine. Il vantaggio principale di questo è che può essere utilizzato per identificare siti onnipresenti EYFP CENP-A K124R con un significato biologico cruciale.Potrebbe essere esteso per studiare le modifiche post-traslazionali di una vasta gamma di proteine funzionali. Inizia preparando la proteina A perline legate con anticorpi anti-GFP. Lavare 25 microlitri di proteine A per reazione di immunoprecipitazione con tampone A1 almeno tre volte per rimuovere l'etanolo.Quindi creare una soluzione di perline del 50% con buffer A1. Aggiungere due microlitri di anticorpo anti-GFP alle perline. Quindi aggiungere il buffer da A1 a 20 volte il volume netto delle perline. Eseguire la rotazione end-to-end a quattro gradi Celsius per quattro-18 ore.La durata ottimale per la rotazione deve essere determinata empiricamente in base all'efficienza dell'immunoprecipitazione. Dopo la rotazione, centrifugare le perline a 100 volte g per un minuto e rimuovere il supernatante non legato. Aggiungere tampone A1 per fare una soluzione al 50% di perline e utilizzare 25 microlitri di questa soluzione per ogni reazione di immunoprecipitazione.Per eseguire l'immunoprecipitazione, liscire le cellule nel tampone A1 tramite sonicazione e congelare/scongelare. Misurare le concentrazioni proteiche e normalizzare le quantità proteiche tra i diversi campioni IP. Quindi rimuovere il 5% del campione da ogni tubo da eseguire nella pagina SDS.Mescolare il resto del lysate con 25 microlitri di proteine A perline legate all'anticorpo anti-GFP ed eseguire la rotazione end-to-end a quattro gradi Celsius per quattro-18 ore. Dopo aver lisciviato le cellule nel tampone A ed eseguito l'immunoprecipitazione come descritto in precedenza, mantenere il 10% degli immunoprecipitanti totali per confermare l'ubiquità CENP-A dell'EYFP e determinare con precisione la posizione dell'EYFP CENP-A ubiquitilato. Utilizzare l'altro 90% per l'analisi della spettrometria di massa.Eseguire il campione di spettrometria di massa in un gel proteico Bis-Tris 4-12%disponibile in commercio. Quindi eseguire la colorazione blu Coomassie e asportare la regione gel da 50-70 kilodalton per l'analisi della spettrometria di massa. Dadi ogni fetta di gel in piccoli pezzi e mettili in un tubo di legame a basso contenuto proteico da 0,5 millilitri.Lavare i pezzi di gel con 100 microlitridi di acetonitrile al 50% in bicarbonato di ammonio millimolare. Vortice per 10-15 minuti. Quindi spinli verso il basso e scarta il supernatante.Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare i pezzi di gel con un concentratore sottovuoto da banco per 30 minuti. Aggiungere 10 microlitri di 10 nanogrammi per microlitri che sequenziano la trippsina e lasciare che i pezzi di gel si reidratano per cinque minuti. Quindi aggiungere 25 bicarbonato di ammonio millimolare, quanto basta per coprire i pezzi di gel e digerirli a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, trasferire il supernatante digerito in un tubo siliconato pulito da 0,65 millilitri e aggiungere il 50% di acetonitrile e la soluzione di acido formico al 5%. Vortice il campione per 10 minuti. Quindi giralo verso il basso e trasferisci il supernatante in un tubo di estrazione.Concentrare nuovamente il campione su due microlitri. Aggiungere quindi otto microlitri di soluzione di acido 3% acetonitrile e 2% formico. Vortice per 15 minuti e girare verso il basso a 16.000 volte g per 30 minuti.Eseguire l'acquisizione dei dati MS con LC-MS/MS utilizzando un sistema di cromatografia liquida abbinato a uno strumento di spettrometria di massa. Iniettare otto microlitri del campione in una colonna di cromatografia liquida in fase inversa e separare i peptidi con un gradiente del 2-80% del solvente B in 60 minuti dopo le indicazioni manoscritte. Raccogliere dati di spettrometria di massa utilizzando la modalità di acquisizione dipendente dai dati.Aprire il software commerciale per analizzare i dati della spettrometria di massa sul desktop. Per avviare una nuova ricerca, fare clic sul pulsante LC nel menu in alto. Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi per caricare i file di dati non elaborati MS originali.Selezionare l'ID proteina umana nel metodo paragon come metodo di ricerca del database e cercare i file di dati raw MS originali nel database UniProt homo sapiens. Selezionare la tripina come enzima di digestione e impostare il resto dei parametri in base alle direzioni del manoscritto. Immettere il nome del file dei risultati e fare clic sul pulsante Salva con nome a destra del menu.Quindi selezionare una cartella per archiviare i risultati della ricerca e fare clic sul pulsante Salva. Fare clic sul pulsante processo per avviare la ricerca. Al termine della ricerca, i dati con il nome di ricerca immesso verranno memorizzati automaticamente nella cartella selezionata.Per ottenere gli spettri MS/MS di qualsiasi peptide specifico, aprire i risultati della ricerca nel software F.Quindi fare clic sulla proteina nell'elenco delle proteine nel menu in alto e fare clic sul peptide nel menu centrale. L'MS/MS di questo peptide apparirà nella parte inferiore del menu. Per esportare e salvare gli spettri MS/MS, copiare gli spettri e incollarli in un formato di file adatto.I costrutti genici di tipo selvatico EYFP CENP-A o mutante K124R che salva la perdita di CENP-A endogeno sono stati espressi stabilmente quando è stata eseguita l'integrazione retrovirale. L'espressione del CENP-A endogeno non è stata rilevata sette giorni dopo l'induzione della ricombinasi di Cre. Sia il tipo selvatico EYFP CENP-A che l'espressione proteica K124R sono risultati ad un livello simile alla proteina CENP-A endogena iniziale.Sia i mutanti selvatici EYFP CENP-A che K124R hanno mostrato la localizzazione del centromero a sette giorni dall'interruzione della restante espressione del CENP-A endogeno. Il tipo selvaggio EYFP CENP-A e il mutante K124R mostravano ubiquità e interazione con HJURP a differenza della cassa per il tipo selvaggio CENP-A contrassegnato o non registrato e il mutante K124R. La vitalità cellulare è stata valutata eseguendo il test di crescita della colonia 14 giorni dopo l'interruzione del rimanente allele endogeno CENP-A.Sia i mutanti selvatici EYFP CENP-A che K124R hanno mostrato un numero simile di colonie salvate 14 giorni dopo l'interruzione del restante allele endogeno CENP-A. La spettrometria di massa IP ha rivelato ubiquisizione a lysine 306 in EYFP CENP-A K124R nelle cellule CENP-A meno F. Tutti insieme, questi risultati hanno suggerito che la fusione di proteine di grandi dimensioni induce ubiquisizione in una lisina diversa da K124R nel CENP-A che inibisce il fenotipo mutante singolo K124R originale.Quando si tenta questo protocollo, utilizzare i gel proteici 4%12%Bis-Tris disponibili in commercio per eseguire i campioni di spettrometria di massa. Aggiungere una tripina adeguata ai pezzi di gel e reidratarli fino a quando tutti gli enzimi non sono stati assorbiti. La tecnica di etichettatura o sondaggio a peso molecolare inferiore è in realtà necessaria per visualizzare l'ubiquitàlazione e indagare la segnalazione di ubiquità della proteina temporale spaziale a livello dell'intero organismo.

mass-spectrometry-analysis-to-identify-ubiquitylation-eyfp-tagged

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Un nuovo metodo che utilizza l'analisi quantitativa di FRET (Förster Resonance Energy Transfer) segnali è descritto per lo studio di cinetica enzimatica.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) analisi per la determinazione della proteasi SENP1 Cinetica

Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Qui riportiamo protocolli per rilevare proteine centromero-cinetocore endogene ed esogene nelle cellule umane e quantificare questi livelli di proteine a centromeri-cinetocori mediante colorazione immunofluorescente indiretta attraverso l'uso di fissazione (paraformaldeide, acetone o metanolo).

Le proteine ​​immunofluorescenza di endogeni ed esogeni Centromere-cinetocoro

Indagando più, modificazioni post-traduzionali endogeni per una proteina bersaglio possono essere estremamente impegnativi. Tecniche descritte qui utilizzano un sistema di tampone e di filtro ottimizzato Lisi sviluppato con PTM-targeting specifico, matrici di affinità per rilevare le modifiche di fosforilazione di acetilazione, ubiquitinazione, sumoilazione 2/3 e tirosina per una destinazione proteine utilizzando un unico sistema semplificato.

Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Scopri l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione di CENP-A con tag EYFP. Questo metodo rivela siti di modificazione post-traduzionali essenziali per la funzione del centromero e la vitalità cellulare.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Esplora altri video