Name: Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri la generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane con bioreattori monouso. Questo protocollo offre un metodo riproducibile per studiare lo sviluppo cerebellare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Fundao para a Ciància e a Tecnologia (FCT), Portogallo (UIDB/04565/2020 attraverso Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Progetto N. 007317, DA PD/BD/105773/2014 a T.P.S e da PD/BD/128376/2017 a D.E.S.N.), progetti cofinanziati da FEDER (POR Lisboa 2020 -Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 20 2020) e FCT attraverso sovvenzione PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 e CEREBEX Generazione di Organoidi Cerebellar per Ataxia Research sovvenzione LISBOA-01-0145-FEDER-029298. I finanziamenti sono stati ricevuti anche dal programma orizzonte 2020 dell'Unione europea per la ricerca e l'innovazione, nell'ambito dell'accordo di sovvenzione numero 739572: il Centro di scoperta per la medicina rigenerativa e di precisione H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Passare e il mantenimento degli iPSC umani nella cultura monostrato
<ol><li>Preparazione delle piastre<ol>
<li>Scongelare la matrice della membrana delseminterrato (vedi Tabella dei Materiali ) stock a 4 gradi centigradi e preparare 60 aliquots di 60 L. Congelare gli aliquots a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Per rivestire i pozzi di una piastra di 6 pozzi, scongelare un aliquot della matrice di membrana seminterrato sul ghiaccio. Una volta scongelato, aggiungere 60 L a 6 mL di DMEM-F12. Rispendere delicatamente pipettando su e giù.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di matrice di membrana diluita a ciascun pozzo di una piastra di 6 pozza bene e incubare a RT per almeno 1 h prima di passare o conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passaggio di colonie iPSC con EDTA<ol>
<li>Mantenere gli iPSC nella coltura monostrato in 6 piastre di pozzo nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, 95% di umidità e 5% CO2. NOTA: in questo protocollo sono state utilizzate tre distinte linee iPSC umane: F002.1A.1321, linea iPSC episomale umana (iPSC6.2)22e iPS-DF6-9-9T.B (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Prima di passare, incubare le piastre conservate (punto 1.1) a temperatura ambiente (RT) per 15 min e preparare il mezzo mTesR1(tabella 1).</li>
		<li>Aspirare la soluzione dalla piastra utilizzando una pipetta sierologica e aggiungere immediatamente 0,5 mL di mTeSR1 media ad ogni pozzo.</li>
		<li>Aspirare il mezzo speso dal pozzo contenente iPSC e lavare una volta utilizzando 1 mL di 0,5 mM EDTA per pozzo.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA ad ogni pozzo e incubare a RT per 5 min.</li>
		<li>Aspirare EDTA e rimuovere le cellule dai pozzetti aggiungendo delicatamente mTeSR1 medio e pipettando le colonie utilizzando una micropipetta P1000. Raccogliere le cellule in un tubo conico. NOTA: non pipettare celle su e giù più di 3x.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare (diluito 1:4) ad ogni pozzo in modo che ogni pozzo contenga 1,5 mL di media dopo l'aggiunta della sospensione cellulare. Restituire le cellule all'incubatrice al 5% di CO2, 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Sostituire il mezzo speso ogni giorno e il passaggio ogni 3 giorni quando si ottiene la confluenza del 75%-80%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Semina di iPSC umani nel bioreactor
<ol><li>iPSC incubati coltivati come monostrati in mTeSR1 integrati con 10 M di inibitore ROCK Y-27632 (ROCKi). Aggiungere 1 mL di mezzo integrato per ogni pozzo da una piastra di coltura del tessuto 6 e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi, 95% di umidità e 5% CO2. NOTA: ROCKi viene utilizzato per proteggere gli iPSC dissociati dall'apoptosi23.</li>
	<li>Dopo 1 h di incubazione, aspirare il mezzo speso da ogni pozzo e lavare 1x con 1 mL di 1× PBS per pozzo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL del mezzo di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) ad ogni pozzo di una piastra di 6 pozzi e incubare a 37 gradi centigradi per 7 min fino a quando le cellule si staccano facilmente dai pozzetti con agitazione delicata.</li>
	<li>Pipetta il distaccamento cellulare medio su e giù con una micropipetta P1000 fino a quando le cellule si staccano e si dissociano in singole cellule. Aggiungere 2 mL di coltura cellulare completa media ad ogni pozzo per inattivare la digestione ezimatica e pipette le cellule delicatamente in un tubo conico sterile.</li>
	<li>Centrifuga a 210 × g per 3 min e rimuovere il supernante.</li>
	<li>Risundere il pellet cellulare in media coltura (cioè, mTeSR1 integrato con 10 M di ROCKi) e contare gli iPSC con un emocitometro utilizzando il colorante blu trypan.</li>
	<li>Seme 15 × 106 cellule singole nel bioretettore (volume massimo di 100 mL) con 60 mL di mTeSR1 integrato con 10 M di ROCKi ad una densità cellulare finale di 250.000 cellule/mL.</li>
	<li>Inserire il recipiente contenente gli iPSC nell'unità di base universale collocata nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, 95% di umidità e 5% CO2. NOTA: l'agitazione del bioreactor viene mantenuta per 24 h impostando il controllo universale dell'unità di base su 27 rpm per promuovere l'aggregazione iPSC.</li>
</ol>3. Differenziazione e maturazione degli aggregati umani derivati da iPSC negli organoidi cerebellari
<ol><li>Definire il giorno del seeding a singola cella come giorno 0.</li>
	<li>Il primo giorno, raccogliere 1 mL del campione di aggregazione iPSC utilizzando una pipetta sierologica. Mantenere il bioreactor in agitazione come prima, posizionando l'unità di base universale con il bioreactor contenente gli aggregati in un flusso sterile prima di raccogliere il campione. Piastra la sospensione cellulare in una piastra di fissamento 24 ultra-bassa. Verificare che siano formate aggregazioni derivate da iPSC.</li>
	<li>Acquisire immagini con un microscopio ottico utilizzando un ingrandimento totale di 40x o 100x per misurare il diametro aggregato.</li>
	<li>Misurare l'area degli aggregati in ogni immagine utilizzando il software FIJI.<ol>
<li>Selezionare "Analizza Impostare Misure "dalla barra dei menu e fare clic su "Area" e "OK".</li>
		<li>Selezionare "File Aprire" dalla barra dei menu per aprire un file di immagine memorizzato. Selezionate lo strumento di selezione delle linee presentato nella barra degli strumenti e create una linea retta sopra la barra della scala presentata nell'immagine. Selezionare "Analizza Impostare la scala" dalla barra dei menu.</li>
		<li>In "Distanza nota"aggiungere la distesa della barra della scala dell'immagine in m. Definirel'" Unità di lunghezza" come m. Fare clic su "Globale" per mantenere le impostazioni e "OK". Selezionate Selezione ovale nella barra degli strumenti.</li>
		<li>Per ogni aggregato delineare l'area con lo strumento ovale. Selezionare "Analizza Misura". Calcolare il diametro in base all'area misurata, considerando che gli aggregati sono approssimativamente sferici <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61143/61143equ01.jpg"> con A come area dell'aggregato.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando il diametro medio degli aggregati è di 100 m, sostituire l'80% del mezzo speso con mTeSR1 fresco senza ROCKi. Quando gli aggregati raggiungono i 200-250 m di diametro, sostituire tutto il mezzo speso con gfCDM(Tabella 1), lasciando che gli organoidi si stabiliscano nella parte inferiore del bioreactor. NOTA: se il diametro aggregato medio supera i 350 m, non avviare il protocollo di differenziazione. Ripetere il seeding di singole celle. Generalmente, l'aggregato impiega circa 1 giorno per raggiungere un diametro medio di 100 m.</li>
	<li>Inserire il bioreactor contenente gli aggregati nell'unità di base universale collocati nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, 95% di umidità e 5% CO2.</li>
	<li>Diminuire l'agitazione del bioreattore a 25 giri/min.</li>
	<li>Nel giorno 2 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4 per valutare il diametro aggregato. Aggiungere 30 L di FGF2 (concentrazione finale, 50 ng/mL) e 60 L di SB431542 (concentrazione finale, 10 M) a 60 mL del mezzo di differenziazione gfCDM(Tabella 1). Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con il gfCDM integrato. Ripetere il passaggio 3.6. NOTA: SB431542 è fondamentale per inibire la differenziazione mesendodermica, inducendo la differenziazione neurale24. FGF2 viene utilizzato per promuovere la caudalizzazione del tessuto neuroepithelial25.</li>
	<li>Nel giorno 5 ripetere i passaggi 3.2, 3.3, 3.4 e 3.8. NOTA: le dimensioni di aggregazione dovrebbero aumentare durante il protocollo di differenziazione. Tuttavia, il diametro è critico solo quando inizia la differenziazione, perché questo parametro potrebbe influenzare l'efficacia della differenziazione.</li>
	<li>Nel giorno 7 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Diluire FGF2 e SB431542 a 2/3: Aggiungere 20 L di FGF2 e 40 L di SB431542 a 60 mL di media di differenziazione gfCDM. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con gfCDM integrato. Ripetere il passaggio 3.6 e aumentare l'agitazione del bioreattore a 30 rpm.</li>
	<li>Nel giorno 14 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Aggiungere 60 L di FGF19 (concentrazione finale, 100 ng/mL) a 60 mL di media di differenziazione gfCDM. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con gfCDM integrato con FGF19. Ripetere il passaggio 3.6. NOTA: FGF19 viene utilizzato per promuovere la polarizzazione delle strutture mid-hindbrain26.</li>
	<li>Nel giorno 18 ripetere i passaggi 3.2, 3.3, 3.4 e 3.11.</li>
	<li>Nel giorno 21 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con un mezzo neurobasale completo (Tabella 1). Ripetere il passaggio 3.6. NOTA: Il mezzo neurobasale è un mezzo basale utilizzato per mantenere la popolazione di cellule neuronali all'interno dell'organoide7.</li>
	<li>Nel giorno 28 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Aggiungere 180 L di SDF1 (concentrazione finale, 300 ng/mL) a 60 mL di mezzo neurobasale completo. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con un mezzo neurobasale completo integrato con SDF1. Ripetere il passaggio 3.6. NOTA: SDF1 viene utilizzato per facilitare l'organizzazione di layer di celle distinte27.</li>
	<li>Nel giorno 35 ripetere i passaggi 3.2, 3.3 e 3.4. Sostituire tutto il mezzo speso dal bioreactor con il mezzo BrainPhys completo (Tabella 1). Ripetere il passaggio 3.6. NOTA: BrainPhys è un mezzo neuronale che supporta i neuroni sinapticamente attivi28.</li>
	<li>Sostituire 1/3 del volume totale ogni 3 giorni con il mezzo BrainPhys completo fino al giorno 90 di differenziazione.</li>
</ol>4. Preparazione degli organoidi per la criosezione e l'immunostochimica
<ol><li>Raccolta di organoidi per l'immunosostenimento<ol>
<li>Raccogliere 1 mL di campione di mezzo contenente organoidi con una pipetta sierologica dal bioretettore a un tubo conico da 15 mL. NOTA: Gli organoidi devono essere raccolti in diversi punti di tempo per valutare l'efficacia della differenziazione, compresi i giorni 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 e 90.</li>
		<li>Togliere il supernatant e lavare una volta con 1 mL di 1× PBS. NOTA: Non centrifugare gli organoidi. Lasciate che gli organoidi si stabiliscano sul fondo del tubo per gravità.</li>
		<li>Rimuovere il supernatant e aggiungere 1 mL del 4% di paraformaldeide (PFA). Incubate a 4 gradi centigradi per 30 min. Rimuovere il PFA speso e aggiungere 1 mL di 1× PBS.</li>
		<li>Conservare gli organoidi in 1 mL di 1× PBS a 4 gradi centigradi fino all'elaborazione per la criosezione. NOTA: Conservare gli organoidi in 1x PBS per non più di 1 settimana dopo la fissazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione degli organoidi per la criosezione<ol>
<li>Rimuovere il supernatant dagli organoidi immagazzinati. Aggiungere 1 mL di 15% di saccarosio (w/v, diluito in 1× PBS), mescolare bene con un leggero vortice e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparare una soluzione di gelatina al 15% di saccarosio/7,5%(tabella 2) e mantenerla a 37 gradi centigradi durante la preparazione per evitare la gelatina da solidificare.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di saccarosio al 15%, aggiungere 1 mL di saccarosio 15%/7,5% di gelatina agli organoidi e mescolare rapidamente con un leggero vortice. Incubate a 37 gradi centigradi per 1 h.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di gelatina 15% di saccarosio/7,5% a un contenitore di plastica fino alla metà del suo volume. Attendere la solidificazione a RT.</li>
		<li>Dopo un'incubazione di 1 h, mettere con cura una goccia di saccarosio/gelatina contenente gli organoidi sulla gelatina solidificata con una pipetta Pasteur. Lasciare solidificare a RT per circa 15 min. Assicurarsi di evitare la formazione di bolle.</li>
		<li>Mettere il 15% di saccarosio/7,5% di gelatina sopra gli organoidi fino a riempire il contenitore. Attendere la solidificazione completa a RT.</li>
		<li>Dopo la solidificazione, incubare 20 min a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Tagliare la gelatina in un cubo contenente gli organoidi al centro e fissare il cubo di gelatina su un pezzo di cartone con una goccia di composto O.C.T.</li>
		<li>Mettere 250 mL di isopentane in una tazza da 500 mL e riempire un contenitore appropriato con azoto liquido. Utilizzando le forpe e i guanti spessi, posizionare con attenzione la tazza contenente isopentane sulla superficie dell'azoto liquido e raffreddare l'isopentane a -80 gradi centigradi.</li>
		<li>Quando si raggiunge -80 gradi centigradi, inserire il cubo di gelatina nella tazza contenente isopentane fino a congelare, mantenendo la temperatura a -80 gradi centigradi. A seconda delle dimensioni del cubo, potrebbe richiedere 1-2 min. NOTA: Evitare temperature inferiori a -80 gradi centigradi o un tempo di congelamento eccessivo, perché potrebbe causare la rottura del cubo.</li>
		<li>Una volta congelato, conservare rapidamente il cubo di gelatina a -80 gradi centigradi e conservarsi fino alla criosezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Criosezione degli organoidi<ol>
<li>Accendere il criostat e definire sia le temperature campione (OT) e criocamera (CT) a -25 gradi centigradi.</li>
		<li>Quando entrambe le temperature si stabilizzano, fissare il cubo di gelatina contenente gli organoidi sul campione utilizzando .C O.T.</li>
		<li>Definite lo spessore della sezione a 12 m.</li>
		<li>Tagliare il cubo e raccogliere 3-4 fette sui vetrini del microscopio ad adesione (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Conservare a -20 gradi centigradi fino all'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunostaining delle fette di organoidi<ol>
<li>Posizionare i vetrini al microscopio contenenti sezioni organoidi in un barattolo di copling con 50 mL di 1x PBS preriguero, tenendo fino a 10 diapositive back-to-back. NOTA: tutte le sezioni organoidi devono essere sommerse con liquido.</li>
		<li>Incubare per 45 minuti a 37 gradi centigradi per degelatinizzare le diapositive.</li>
		<li>Lavare 1x con 50 mL di 1× PBS per 5 min a RT: Trasferire le diapositive in un barattolo di copling contenente 1× PBS.</li>
		<li>Trasferire i vetrini in un barattolo di cova contenente 50 mL di glicina appena preparata(tabella 2) e incubare per 10 min a RT.</li>
		<li>Trasferire le diapositive in un barattolo di copling contenente 50 mL di tritone dello 0,1%(tabella 2) e permeabilizzare per 10 min a RT.</li>
		<li>Lavare con 1× PBS per 5 min 2x.</li>
		<li>Preparare il piatto immunostaining con carta da 3 mm imbevuta di 1× PBS. Asciugare i vetrini con un tessuto intorno alle fette e posizionarli su carta da 3 mm. Con una pipetta Pasteur, coprire l'intera superficie dei vetrini con soluzione di blocco (Tabella 2) con 0,5 mL per diapositiva. Incubare per 30 min a RT.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di blocco in eccesso e asciugare i vetrini con un tessuto intorno alle fette. Posizionare 50 L dell'anticorpo primario (Tabella 3) diluito nella soluzione di bloccaggio sopra le sezioni e coprire con le coperture. Mettere le fette in un piatto immunostaining preparato in precedenza. Incubare durante la notte a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Trasferire i vetrini in un barattolo di copling con 50 mL di TBST (Tabella 2), lasciare cadere le coperture e lavare con TBST per 5 min 3x.</li>
		<li>Posizionare 50 L dell'anticorpo secondario diluito nella soluzione di bloccaggio sulle sezioni e coprire con le coperture. Mettere le fette nel piatto immunostaining preparato in precedenza. Incubare per 30 minuti a RT, protetto dalla luce.</li>
		<li>Trasferire nuovamente i vetrini in un barattolo di copling e lavare con 50 mL di TBST per 5 min 3x.</li>
		<li>Asciugare i vetrini con un tessuto intorno alle fette e posizionare le fette in un piatto immunostaining preparato in precedenza. Aggiungere 0,5 mL di soluzione DAPI su tutta la superficie dei vetrini con una pipetta Pasteur. Incubare per 5 minuti a RT.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.4.9.</li>
		<li>Asciugare con cura i vetrini con un tessuto. Aggiungere 50 L di montaggio medio goccia a goccia lungo il scivolo e quindi abbassare con attenzione un coperture su ogni diapositiva, piegando leggermente per evitare bolle.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori YH e SJ sono dipendenti di PBS Biotech. L'autore BL è CEO e co-fondatore di PBS Biotech, Inc. Questi autori che collaborarono hanno partecipato allo sviluppo dei bioreattori utilizzati nel manoscritto. Ciò non altera l'adesione degli autori a tutte le politiche della rivista sulla condivisione di dati e materiali. Tutti gli altri autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

La necessità di grandi numeri di cellulare e di condizioni di coltura definite per generare tipi di cellule specifiche per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa ha guidato lo sviluppo di sistemi di coltura scalabili. Negli ultimi anni, diversi gruppi hanno segnalato la generazione scalabile di progenitori neurali e neuroni funzionali32,33,34, fornendo progressi significativi nello sviluppo di nuov...

L'emergere di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) rappresenta un ottimo strumento per la medicina rigenerativa e la modellazione della malattia, perché queste cellule possono essere differenziate nella maggior parte delle linee cellulari del corpoumano 1,2. Dalla loro scoperta, la differenziazione PSC utilizzando approcci diversi è stata segnalata per modellare diverse malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi3,4,5,6.
Recentemente, ci sono state segnalazioni di colture 3D derivate da PSC simili a strutture cerebrali umane; questi sono chiamati organoidi cerebrali3,7,8. La generazione di queste strutture da PSC sani e specifici per il paziente offre una preziosa opportunità per modellare lo sviluppo umano e i disturbi del neurosviluppo. Tuttavia, i metodi utilizzati per generare queste strutture cerebrali ben organizzate sono difficili da applicare per la loro produzione su larga scala. Per produrre strutture sufficientemente grandi da ricapitolare la morfogenesi dei tessuti senza necrosi all'interno degli organoidi, i protocolli si basano sull'impegno neurale iniziale in condizioni statiche, seguito dall'incapsulamento negli idrogel e dalla successiva coltura nei sistemidinamici 3. Tuttavia, tali approcci possono limitare il potenziale aumento della produzione di organoidi. Anche se sono stati fatti sforzi per dirigere la differenziazione PSC a specifiche regioni del sistema nervoso centrale, tra cui corticale, striatale, midbrain, e neuroni del midollo spinale9,10,11,12, la generazione di regioni cerebrali specifiche in condizioni dinamiche è ancora una sfida. In particolare, la generazione di neuroni cerebellari maturi in strutture 3D deve ancora essere descritta. Muguruma et al. ha aperto la strada alla generazione di condizioni di coltura che ricapitolano lo sviluppo cerebellareprecoce 13 e ha recentemente riportato un protocollo che consente alle cellule staminali embrionali umane di generare una struttura polarizzata che ricorda il primo cervellettodel trimestre 7. Tuttavia, la maturazione dei neuroni cerebellari negli studi riportati richiede la dissociazione degli organoidi, lo smistamento dei progenitori cerebellari e la coculazione con cellule di alimentazione in un sistema di coltura monostrato7,14,15,16. Pertanto, la generazione riproducibile degli organoidi cerebellari desiderati per la modellazione della malattia in condizioni definite è ancora una sfida associata alla variabilità della coltura e dell'alimentazione.
Questo protocollo presenta condizioni di coltura ottimali per l'espansione 3D e la differenziazione efficiente dei PSC umani nei neuroni cerebellari utilizzando bioreattori a ruota verticale monoiose (vedi Tabella dei materiali per le specifiche), in seguito chiamati bioreattori. I bioreattori sono dotati di un grande impeller verticale, che in combinazione con un fondo a forma di U, fornisce una distribuzione di taglio più omogenea all'interno del vaso, consentendo una miscelazione delicata e uniforme e sospensioni di particelle con velocità di agitazioneridotte 17. Con questo sistema, è possibile ottenere aggregati cellulari controllati da forma e dimensioni, che è importante per una differenziazione più omogenea ed efficiente. Inoltre, un maggior numero di organoidi derivati da iPSC può essere generato in modo meno laborioso.
La caratteristica principale degli organoidi, che sono strutture multicellulari 3D di solito formate da cellule staminali, è l'auto-organizzazione di diversi tipi di cellule che forma forme specifiche come quelle osservate nella morfogenesiumana 18,19,20. Pertanto, la morfologia organoide è un criterio importante da valutare durante il processo di differenziazione. La criosezione degli organoidi e l'ulteriore immunosostenimento delle fette di organoidi con un insieme specifico di anticorpi consentono la visualizzazione spaziale dei marcatori molecolari per analizzare la proliferazione cellulare, la differenziazione, l'identità della popolazione cellulare e l'apoptosi. Con questo protocollo, immunostaining criosezioni organoidi, un impegno neurale efficiente iniziale è osservatodal 7 esimo giorno di differenziazione. Durante la differenziazione, vengono osservate diverse popolazioni di cellule con identità cerebellare. Dopo 35 giorni in questo sistema dinamico, il neuroepithelium cerebellare si organizza lungo un asse apicobasale, con uno strato apico di progenitori proliferanti e neuroni postmitotici situati in modo basalmente. Durante il processo di maturazione, dai giorni 35-90 di differenziazione, si possono vedere tipi distinti di+neuroni cerebellari, tra cui le cellule Purkinje (Calbindin , , le cellule di granulo (PAX6+- /MAP2, le cellule di Golgi (Neurogranin+), le cellule del pennello unipolare (TBR2+) e i neuroni di proiezione nuclei cerebellari profondi (TBR1 ) .+ Inoltre, una quantità non significativa di morte cellulare è osservata negli organoidi cerebellari generati dopo 90 giorni in coltura.
In questo sistema, gli organoidi umani derivati da iPSC maturano in diversi neuroni cerebellari e sopravvivono fino a 3 mesi senza la necessità di dissociazione e coculazione di alimentatori, fornendo una fonte di neuroni cerebellari umani per la modellazione della malattia.

Carta <table><tbody><tr><td>da 3 mm</td><td>WHA3030861</td><td>Merck</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A6964 - 500mL</td><td>Terreno di distacco cellulare</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-BARHL1 Anticorpo</td><td>HPA004809</td><td>Atlas Anticorpi</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindina D-28k Anticorpo</td><td>CB28</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Anticorpo</td><td>M4403</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-Caderina</td><td>610921</td> Anticorpo anti-NESTIN per <td>trasduzione</td><td></td>BD</tr><tr><td></td><td>MAB1259-SP</td><td>R& D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-OLIG2</td><td>MABN50</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PAX6</td><td>PRB-278P</td><td>Covance</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SOX2</td><td>MAB2018</td><td>R& D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-TBR1</td><td>AB2261</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-TBR2</td><td>ab183991</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-TUJ1</td><td>801213</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>T1147</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys Neuronale Medium N2-A & SM1 Kit</td><td>5793 - 500mL</td> Tecnologie <td></td><td>per cellule staminali</td></tr><tr><td>Concentrato lipidico chimicamente definito</td><td>11905031</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 24x60mm</td><td>631-1575</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Cristallizzazione purificata BSA</td><td>5470</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>10236276001</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyryl cAMP</td><td>SC- 201567B -500mg</td><td>Frilabo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>32500-035</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>A3840001</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle bovina</td><td>G9391</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Glass Copling Jar</td><td>E94</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>10566-016</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MB014001</td><td>NZYtech</td><td></td></tr><tr><td>Prosciutto' s F12</td><td>21765029</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr> Human <tr><td>Episomal iPSC Line</td><td>A18945</td><td>ThermoFisher</td><td>iPSC6.2</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>12440046</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>91077C</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>iPS DF6-9-9T. B</td><td></td><td>WiCell</td><td></td></tr><tr><td>Iso-pentano</td><td>PHR1661-2ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>A-92902</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>354230</td><td>Matrice della membrana basale</td><td>Corning</td></tr><tr><td>Monotioglicerina</td><td>M6154</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>475904</td><td>Mezzo di montaggio</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>85850 -500 ml</td> Tecnologie <td></td><td>delle cellule staminali</td></tr><tr><td>Integratore N2</td><td>17502048</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>12348017</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>158127</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>PBS-0.1 Recipiente monouso</td><td>SKU: IA-0.1-D-001</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td><td>SKU: IA-UNI-B-501</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano BDNF</td><td>450-02</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano bFGF/FGF2</td><td>100-18B</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano FGF19</td><td>100-32</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano GDNF</td><td>450-10</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante umano SDF1</td><td>300-28A</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inibitore Y-27632</td><td>72302</td> Tecnologie <td></td><td>delle cellule staminali</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>S4317</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>S7903</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Vetrini per microscopio</td><td>12372098</td><td>ThermoFisher ThermoFisher</td> Adesivo per <td>microscopio</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>25608-930</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL 1M</td><td>T3038-1L</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>9002-93-1</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>P1379</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>15575020</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Il cervelletto svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'equilibrio e della coordinazione motoria, e un difetto funzionale in diversi neuroni cerebellari può innescare disfunzione cerebellare. La maggior parte delle conoscenze attuali sui fenotipi neuronali correlati alla malattia si basa sui tessuti post-mortem, il che rende difficile la comprensione della progressione e dello sviluppo della malattia. I modelli animali e le linee cellulari immortalate sono stati utilizzati anche come modelli per i disturbi neurodegenerativi. Tuttavia, non ricapitolano completamente la malattia umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) hanno un grande potenziale per la modellazione della malattia e forniscono una fonte preziosa per gli approcci rigenerativi. Negli ultimi anni, la generazione di organoidi cerebrali da iPSC derivati dal paziente ha migliorato le prospettive per la modellazione delle malattie neurodegenerative. Tuttavia, mancano protocolli che producono un gran numero di organoidi e un'elevata resa di neuroni maturi nei sistemi di coltura 3D. Il protocollo presentato è un nuovo approccio per la generazione riproducibile e scalabile di organoidi umani derivati da iPSC in condizioni chimicamente definite utilizzando bioreattori mono uso scalabili, in cui gli organoidi acquisiscono l'identità cerebellare. Gli organoidi generati sono caratterizzati dall'espressione di marcatori specifici sia a livello di mRNA che di proteine. L'analisi di specifici gruppi di proteine consente di rilevare diverse popolazioni di cellule cerebellari, la cui localizzazione è importante per la valutazione della struttura organoide. La criosezione organoide e l'ulteriore immunosostenimento delle fette organoidi vengono utilizzate per valutare la presenza di specifiche popolazioni di cellule cerebellari e della loro organizzazione spaziale.

Il protocollo è stato avviato promuovendo l'aggregazione cellulare utilizzando i bioreattori 0,1 L (Figura 1A). È stata eseguita l'inoculazione a singola cellula degli iPSC, con 250.000 cellule/mL semitesse in 60 mL di media con una velocità di agitazione di 27 rpm. Questo è stato definito come giorno 0. Dopo 24 h, le cellule formavano in modo efficiente aggregati a forma di sferoide (giorno 1, Figura 1B), e la morfologia era ben mantenuta fino al giorno 5, con ...

Questo protocollo descrive un sistema di coltura dinamica per produrre aggregati di dimensioni controllate delle cellule staminali pluripotenti umane e stimolare ulteriormente la differenziazione negli organoidi cerebellari in condizioni chimicamente definite e senza alimentatori utilizzando un bioreaettore monouso.

Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Presentiamo per la prima volta un nuovo approccio per la generazione riproducibile e scalabile, di cellule IPS derivate presso Organoidi Cerebellari, e condizioni chimiche definite, utilizzando bioreattori ad uso singolo. Per ottenere cellule per la semina del bio-reattore, aggiungere un millilitro di mezzo di distacco cellulare, ad ogni pozzo di una piastra di sei pozzi di iPSC umani. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per sette minuti, fino a quando uno scuotimento delicato stacca facilmente le cellule, dal pozzo.Utilizzando una micropipetta P 1000, pipettare il mezzo di distacco cellulare, su e giù, fino a quando le cellule non si dissociano in singole cellule. Successivamente aggiungere due millilitri, di mezzo di coltura cellulare completo ad ogni pozzo, questo inattiva la digestione enzimatica. Quindi utilizzare la pipetta, per trasferire delicatamente le cellule in un tubo conico sterile.Centrifugare il tubo a 210 volte la gravità per tre minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare nel mezzo di coltura. Contare le cellule usando un emocitometro e una tintura blu di tripano.Vedi il vaso bioreattore con l'iPSC, ad una densità di 250.000 cellule per millilitro. Inserire il recipiente bioreattore, nell'unità di base universale, in un incubatore a 37 gradi Celsius, 95% di umidità e 5% di anidride carbonica. Per promuovere l'aggregazione iPSC, impostare il tasso di agitazione dell'unità di controllo di base su 27 RPM.Il primo giorno, con il giorno zero che è il giorno della semina del bioreattore, posizionare il bioreattore e l'unità di base in una cappa di flusso sterile, quindi utilizzare una pipetta sierologica, per raccogliere un campione di millilitro, della sospensione cellulare. Placcare le sospensioni cellulari in un attacco ultra basso, piastra da 24 pozzi. Utilizzare un microscopio per confermare che si sono formati aggregati derivati da iPSC.In tal caso, catturare le immagini degli aggregati a 40 X o 100 X.Continuare a coltivare l'iPSC e il bioreattore, fino a quando il diametro medio degli aggregati, è di 100 micrometri, quindi sostituire l'80% del mezzo, con MT01 fresco senza inibitore della roccia. Quando gli aggregati, raggiungono i 200-250 micrometri di diametro, lasciare depositare tutti gli organoidi, nella parte inferiore del bioreattore, quindi sostituire tutto il mezzo speso, con il mezzo di differenziazione gfCDM. Posizionare l'unità di base e il bioreattore nell'incubatore e diminuire l'agitazione a 25 giri/min.Dopo aver rimosso il supernatante dagli organoidi immagazzinati, aggiungere un millilitro di saccarosio al 15% al pellet e mescolare bene ruotando delicatamente. Dopo aver incubato gli organoidi durante la notte, a quattro gradi Celsius, rimuovere la soluzione di saccarosio, quindi aggiungere un millilitro di saccarosio al 15%, gelatina al 7,5% e mescolare rapidamente ruotando delicatamente. Mentre gli organoidi stanno incubando a 37 gradi Celsius riempiono un contenitore di plastica a metà strada con la soluzione di gelatina al 15% di saccarosio al 7,5% e gli permettono di solidificarsi.Dopo che gli organoidi hanno incubato per un'ora, utilizzare una pipetta Pasteur, per posizionare una goccia della miscela di gelatina di saccarosio organoide, sopra il saccarosio solidificato e la gelatina. Dopo aver aspettato 15 minuti che la goccia si solidifichi, riempire il resto del contenitore di plastica, con più 15% di saccarosio, 7,5% di gelatina, lasciarlo solidificare completamente a temperatura ambiente e quindi incubarlo per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Tagliare la gelatina in un cubo, con gli organoidi al centro, fissare il cubo a un pezzo di cartone, con una goccia di composto OCT, quindi posizionare 250 millilitri di Isopentane, in una tazza da 500 millilitri, riempire un contenitore appropriato, con azoto liquido.Utilizzando forcep e guanti spessi, posizionare con cura la tazza di Isopentane, sulla superficie dell'azoto liquido. Gli azoto isopentane e liquidi sono reagenti pericolosi. L'uso di questi due reagenti richiede dispositivi di protezione individuale, compresi guanti spessi e un'adeguata ventilazione.Quando l'Isopentane, si è raffreddato a -80 gradi Celsius, posizionare il cubo di gelatina nell'Isopentane fino a quando non si congela. Un cubo ben congelato, produce un suono metallico quando leggermente maschiato con forcep, indicando che è pronto per essere conservato. Lavare i vetrini del microscopio contenenti le sezioni organoidi, con 50 millilitri 1X PBS per cinque minuti, quindi trasferire le diapositive in un barattolo coplin, contenente PBS fresco 1X.Trasferire le diapositive in un barattolo coplin, contenente 50 millilitri di glicina appena preparata e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire gli scivoli in un barattolo coplin, contenente 50 millilitri dello 0,1% di Tritone, e permeabili per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le diapositive due volte con 1X PBS, per cinque minuti ogni volta. Preparare il piatto immunostaining, con carta da tre millimetri, imbevuto di 1X PBS.Asciugare gli scivoli con un tessuto tutto intorno alle fette e posizionarli sulla carta da tre millimetri. Con una pipetta Pasteur, coprire ogni diapositiva con 0,5 millilitri di soluzione di blocco. Dopo aver incubato per 30 minuti a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di blocco in eccesso e guidare le diapositive con un tessuto, tutto intorno alle fette.Posizionare 50 microlitri di anticorpo primario diluito, su ogni diapositiva e coprirli con scivolamenti di copertura. Allagare le diapositive, nel piatto immunostaining precedentemente preparato, e incubarle a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, trasferire le diapositive in un barattolo di Coplin, con 50 millilitri di TBST, lasciando cadere il coperchio, quindi lavare gli scivoli tre volte con TBST, per cinque minuti ogni volta.Posizionare 50 microlitri, di anticorpi secondari diluiti su ogni scivolo, e coprire con gli scivolamenti di copertura. Posizionare gli scivoli, nel piatto immunostaining precedentemente preparato, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Trasferire nuovamente le diapositive in un barattolo coplin e lavarle tre volte con 50 millilitri di TBST, per cinque minuti ogni volta.Utilizzando una pipetta Pasteur, a 0,5 millilitri di soluzione dappy, su tutta la superficie di ogni scivolo e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo 24 ore nel bioreattore, gli aggregati a forma di sferoide formati in modo efficiente di iPSC. La morfologia è stata ben mantenuta fino al quinto giorno, con un graduale aumento delle dimensioni.Dimostrando un alto grado di omogeneità. Un'analisi quantitativa per microscopia, ha rivelato anche la distribuzione normale, delle dimensioni aggregate per primo giorno, ed entrambe le linee cellulari hanno raggiunto la dimensione aggregata ottimale per il secondo giorno. Dopo aver raggiunto il diametro aggregato desiderato, è stato indotto l'impegno neurale, e quindi la generazione di diversi progenitori cerebellari è stata promossa.Durante la differenziazione organoidi, ha mostrato un'epitelializzazione più pronunciata simile alle strutture simili a tubi neurali con spazio luminare. Inoltre, la distribuzione del diametro organoide, era omogenea durante l'impegno cerebellare iniziale fino al giorno 14. L'analisi dell'immunofluorescenza supporta, che un impegno neurale efficiente, degli organoidi derivati dall'iPSC, è già raggiunto, al settimo giorno di differenziazione.Immunostaining ha anche dimostrato, efficiente impegno cerebellare e maturazione efficiente degli organoidi cerebellari. Inoltre, dopo 80 giorni nel bioreattore, la colorazione morta viva degli organoidi ha mostrato un'elevata vitalità cellulare e nessuna evidenza di aree necrotiche. Questa tecnica rappresenta uno strumento importante, per lo studio delle vie patologiche, coinvolto nella degenerazione del cerebellare osservato in e per valutare l'effetto terapeutico di nuovi farmaci.

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Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining (Video) | JoVE Journal

Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

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