Name: Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Impara il rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza su fibroblasti. Questo metodo consente imaging di alta qualità e studi sui disordini delle basali corporee.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Difesa della Repubblica Ceca - Piano di sviluppo dell'organizzazione a lungo termine Aspetti medici delle armi di distruzione di massa della Facoltà di Scienze della salute militare, Università della Difesa; il Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport, repubblica Ceca (Progetto di Ricerca Specifico n. Grazie anche a Daniel Diaz per la sua gentile assistenza nella revisione in lingua inglese.

1. Preparazione di mezzi di coltura, soluzioni e piatti
<ol><li>Autoclave le copertine (22 x 22 mm). Preparare 6 piastre di pozzo. Scongelare il siero bovino fetale (FBS) e la penicillina/streptomicina antibiotica e riscaldare la temperatura ambiente media e ambiente di coltura (RT). Utilizzare trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (fosfato tamponato salino con calcio e magnesio) per passare le cellule.</li>
	<li>Preparare la paraformaldeide fresca del 4% (PFA) in dH2O (800 mg di PFA in 20 mL di dH2O). Il PFA deve essere preparato per ogni esperimento. Mescolare e riscaldare la soluzione a 55 gradi centigradi per 30 minuti nel cofano. Raffreddare a RT. Aggiungere 1 M di idrossido di sodio fino a quando la soluzione diventa chiara (pH - 7,2–7,4). Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana. Nota: PFA è tossico; indossare sempre adeguate attrezzature di protezione personale e prepararsi nel cappuccio chimico.</li>
	<li>Preparare 500 mL di mezzi di coltura, DMEM (mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco) contenente il 10% di FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 2% di glutammina.</li>
	<li>Preparare 13 mL di soluzione di gelatina dell'1% in dH2O sterile (130 mg di gelatina in 13 mL di dH2O). Utilizzare 2 mL di 1% gelatina per ogni pozzo in un piatto 6 bene. Mantenere sterile.</li>
	<li>Pulire il cofano a flusso laminare con il 70% di etanolo. Posizionare il materiale richiesto all'interno del cofano di flusso laminare prima di iniziare l'esperimento.</li>
</ol>2. Coltura cellulare per la colorazione dell'immunocitochimica
<ol><li>Scongelare le cellule (in questo studio C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti della pelle) utilizzando tecniche standard e placcarle in una fiaschetta T75 integrata con 10-12 mL dei supporti preparati. Incubare a 37 gradi centigradi/5% di CO2/90% di umidità relativa (RH) fino a quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza.</li>
	<li>Rimuovere le cellule dall'incubatrice e posizionarle nel cofano a flusso laminare. Rimuovere i supporti di coltura e risciacquare brevemente le cellule 2x con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di 0,25% di trypsin-EDTA nella fiaschetta T75 e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Controllare periodicamente il microscopio invertito per monitorare il distacco delle cellule. NOTA: il tempo di incubazione dipende dalla linea della cella e pertanto deve essere determinato empiricamente.</li>
	<li>Risundere delicatamente le cellule in 10 mL di supporti di coltura, pipettando con attenzione per creare una sospensione a singola cella. Se necessario, sciacquare nuovamente il pallone.</li>
	<li>Posizionare la sospensione della cella in un tubo conico di 50 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g. Decantare il supernatant, aggiungere 10 mL di mezzi di coltura, e delicatamente rispendere il pellet. Prendere 20 L della sospensione cellulare e mescolare in un rapporto 1:1 con blu trypan e contare in un citometro seguendo il metodo standard.</li>
	<li>Mettere un coperture all'interno di ogni pozzo di un piatto 6 ben con una pinzetta. Rivestire le coperture con gelatina versando 2 mL nei pozzetti. Questo aiuterà le celle ad attaccarsi alle coperture. Togliere la soluzione di gelatina e lasciare asciugare l'aria per qualche minuto. Le coperture sono ora pronte per la coltivazione delle cellule. Avviare immediatamente la coltivazione.</li>
	<li>Semina 100.000 fibroblasti in ogni pozzo e aggiungi 2 mL di media culturali. Incubare le cellule per 24 h a 37 s /5% CO2/90% RH. A questo punto, le cellule possono essere trattate in base alle esigenze dell'utente. I trattamenti per indurre la ciliazione sono stati descritti in precedenza4,5. NOTA: Il numero di seeding iniziale dipende dal tempo di raddoppio delle celle e deve essere determinato di conseguenza.</li>
</ol>3. Colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie in vitro
<ol><li>Riscaldare la paraformaldeide del 4% a RT. Preparare le pipette Pasteur, 1x PBS (RT), il contenitore dei rifiuti, i tubi conici da 15 mL, le micropipette (0,5–10 L, 20–200 L e 100–1.000 L) e le punte. Prendi le cellule dall'incubatrice e posizionale nella panca. NOTA: La procedura di colorazione non deve essere eseguita in condizioni sterili. Tutte le soluzioni devono essere disponibili in RT.</li>
	<li>Rimuovere i supporti da ogni pozzo. Lasciare il coperto all'interno del pozzo. Lavare delicatamente le celle 3x con 2 mL di 1x PBS. Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere 2 mL del 4% PFA in ogni pozzo per fissare le cellule. Incubare per 10 min a RT. Rimuovere il PFA e lavare 3x con 1x PBS. NOTA: Utilizzare sempre un volume sufficiente per coprire l'intero coperti durante i periodi di incubazione. Non lasciare mai asciugare le cellule. Non versare mai nessuna delle soluzioni direttamente sul coperto.</li>
	<li>Preparare 0,5% Triton X-100 in 13 mL di 1x PBS 10 min prima dell'uso. Aggiungere 2 mL in ogni pozzo. Incubare per 15 min. Lavare delicatamente 4x con 1x PBS. NOTA: Triton X-100 è insolubile in PBS a RT. Riscaldare la soluzione Triton X-100 dello 0,5% a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua per scioglierla.</li>
	<li>Scongelare il siero di capra 5 minuti prima dell'uso. Diluire il siero di capra in 1x PBS in un rapporto 1:20 come soluzione di blocco. Aggiungere 150 L a ciascuna coverslip e incubare per 20 min a RT. NOTA: Prolungare il periodo di blocco fino a 60 min se necessario. Non lavare le cellule dopo aver bloccato con siero di capra.</li>
	<li>Scongelare gli anticorpi primari (ad esempio, tubulina alfa anti-acetilatata e tubulina anti-gamma) 5 minuti prima dell'uso. Diluire gli anticorpi separatamente in 1x PBS come segue: tubulina alfa anti-acetilatata del topo in un rapporto 1:800 e tubulina anti-gamma del coniglio in un rapporto 1:300. Rimuovere la soluzione di blocco. Non lavare. Aggiungere 150 L di entrambe le diluizioni anticorpo alle coperture e incubare per 60 min a RT. NOTA: Se l'incubazione durante la notte utilizza 500–1.000 L delle soluzioni anticorpale primarie, sigillare la piastra del pozzo 6 con pellicola di paraffina e conservarlo a 4 gradi centigradi. In alternativa, utilizzare 150 L di anticorpi e incubare in una camera di umidità.</li>
	<li>Rimuovere gli anticorpi primari. Lavare i coperture molto delicatamente 3x con 2 mL di 1x PBS. Preparare gli anticorpi secondari in 1x PBS diluendo separatamente Cy3 pecora anti-topo e Alexa Fluor488 capra anti-coniglio in un rapporto 1:300. Aggiungere 150 L di entrambe le diluizioni secondarie degli anticorpi alle coperture. Incubare per 45 minuti a RT al buio. NOTA: Incubare al buio per evitare la fotobleaching. Altre combinazioni di anticorpi secondari possono essere utilizzate in base alle esigenze.</li>
	<li>Preparare una soluzione DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) secondo le istruzioni del produttore. Conservare le aliquots in eccesso a -20 gradi centigradi. Diluire 10 L da un aliquot azionario (1:5.000) in 50 mL di 1x PBS. Aggiungere 2 mL di questa diluizione alle coperture. Incubare per 5 minuti a RT al buio. NOTA: È importante incubare le cellule al buio per evitare il fotobleaching. La diluizione DAPI può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.</li>
	<li>Preparare 2 aghi, scivoli, pinzette e supporti di montaggio. Etichettare le diapositive.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione DAPI dai pozzetti. Lavare 3x con 1x PBS. Inserire una goccia di supporto di montaggio su ogni diapositiva. Utilizzare l'ago per sollevare delicatamente il coperture dal fondo del pozzo. Capovolgere il coperto utilizzando le pinzette e posizionarlo delicatamente sopra la goccia del supporto di montaggio. Rimuovere con attenzione eventuali bolle.</li>
	<li>Proteggere i vetrini dalla luce e conservarli durante la notte a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Utilizzare un microscopio fluorescente o confocale con ingrandimento elevato per visualizzare le ciglia primarie. NOTA: Le diapositive possono essere conservate al buio a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.</li>
</ol>

<ol><li>Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+primary+cilia%3A+a+sensory+part+of+centrosomal+complex+in+tissue+cells%2C+but+a+%22sleeping+beauty%22+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells.</a> Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Primary+cilia%22">Primary cilia</a>. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).</li>
<li>Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+levels+of+cytosolic+tubulin+regulate+ciliary+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+increases+primary+cilia+incidence+and+induces+multiciliation+in+C2C12+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts.</a> Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).</li>
<li>Filipová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxic+effect+of+cytostatics+on+primary+cilia+frequency+and+multiciliation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).</li>
<li>Gadadhar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+glycylation+controls+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tubulin glycylation controls primary cilia length.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).</li>
<li>Shamloo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Hypobaric+Hypoxia+Modulates+Primary+Cilia+Differently+in+Adult+and+Fetal+Ovine+Kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys.</a> Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).</li>
<li>Malone, A. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+mediate+mechanosensing+in+bone+cells+by+a+calcium-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).</li>
<li>Luesma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neurons+show+a+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enteric neurons show a primary cilium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).</li>
<li>Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEF1-dependent+Aurora+A+activation+induces+disassembly+of+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium.</a> Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+transition+zone+activation+of+phosphorylated+Tctex-1+controls+ciliary+resorption%2C+S-phase+entry+and+fate+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).</li>
<li>Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+reciliation+of+RPE1+cells+in+late+G1+phase%2C+and+ciliary+localisation+of+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1.</a> FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).</li>
<li>Malicki, J. J., Johnson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cilium%3A+Cellular+Antenna+and+Central+Processing+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit.</a> Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Morleo, M., Franco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autophagy-Cilia+Axis%3A+An+Intricate+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship.</a> Cells. 8 (8), 905(2019).</li>
<li>Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtt%2C+C+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).</li>
<li>Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+epithelial+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).</li>
<li>Lauring, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+software+for+automated+cilia+detection+in+cells+%28ACDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">New software for automated cilia detection in cells (ACDC).</a> Cilia. 8 (1), 1(2019).</li>
<li>Conroy, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-NAP1+and+rootletin+restrain+DNA+damage-induced+centriole+splitting+and+facilitate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).</li>
<li>Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKim%2C+JH+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22">Biochimica et Biophysica Acta</a>. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+decreased+in+breast+cancer%3A+analysis+of+a+collection+of+human+breast+cancer+cell+lines+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).</li>
<li>Smith, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+HDAC6+Activity+Modulates+Ciliogenesis+and+Subsequent+Mechanosensing+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).</li>
<li>Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+loss+in+mammalian+cells+occurs+predominantly+by+whole-cilium+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding.</a> PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).</li>
<li>Hua, K., Ferland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+can+differentially+affect+ciliary+protein+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling.</a> Cilia. 6 (1), 5(2017).</li>
<li>Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+detection+of+primary+cilia+in+endothelial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models.</a> Cilia. 4, 11(2015).</li>
<li>DiDonato, D., Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+the+study+of+lipid+droplets+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Diversi autori hanno descritto diversi metodi per il rilevamento delle ciglia primarie, a volte anche descrivendo vari metodi di fissazione che possono influenzare il lororilevamento 6,20,21,22. Indipendentemente da ciò, è difficile trovare un protocollo completo e diretto per il rilevamento. La disponibilità di tale metodo sarebbe indubbiamente di grande aiuto per lo studio dell'indagine prima...

Le ciglia primarie sono strutture sensoriali, solitarie, legate alla membrana e nonmotile associate alla centriola madre della cellula. Le ciglia primarie si trovano sulla maggior parte delle cellule vertebrate, ad eccezione dei globuli rossi, degli adidociti1e degli epariti2. Le ciglia primarie sono formate come un asceone allungato composto da microtubuli, il cui componente principale è la tubulina. L'ascia cresce dal corpo basale, strutturato γ-tubulina. La lunghezza delle ciglia primarie varia tra 2 e 10 m; tuttavia, le sue dimensioni possono cambiare durante la glicilazione, la fame, l'ipossia, lo stress citotossico o dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti3,4,5,6,7. Di solito, le cellule hanno un solo cilio primario, che è coinvolto nella morfogenesi e nei percorsi di segnalazione cellulare importanti per la proliferazione cellulare e la differenziazione8,9.
Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1, e riassorbite prima di entrare nella mitosi in un processo associato alla deacetilazione della tubulina mediata da HDAC6 (deacetilase istone 6)10. Il momento esatto della riassorbimento delle ciglia primarie dipende dal tipo di cellula e dall'espressione dei geni direttamente coinvolti in questo processo, come Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. A seconda del tipo di cellula, le ciglia primarie esprimono diversi tipi di recettori, canali ioni e percorsi di segnalazione attivi. Questi includono i più importanti recettori di segnalazione che influenzano la proliferazione e la sopravvivenza, EGFR, PDGFR, e FGFR. Sono inclusi anche alcuni dei percorsi di segnalazione che possono influenzare la funzione di uno o più organi, tra cui Riccio, Notch, e Wnt. Grazie a questi recettori e vie di segnalazione, le ciglia primarie svolgono anche una funzione chemiosensoriale. Questa funzione consente alle ciglia primarie di rilevare ligand specifici per Notch, ormoni, e sostanze biologicamente attive come serotonina o somatostatina. Altre funzioni specifiche esposte da ciglia primarie di diverse lunghezze includono la reazione ai cambiamenti di temperatura, gravità e osmolalità14.
Le ciglia primarie possono essere visualizzate attraverso vari metodi, come la visualizzazione dal vivo, la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o il software per il rilevamento automatico delle cigliaprimarie 5,15,16,17. Tuttavia, questi metodi sono altamente specializzati e la ricerca in corso ha bisogno di metodi di base, veloci e facili per colorare le ciglia primarie in ogni fase della ricerca. Descritto è un metodo facile e utile per il rilevamento delle ciglia primarie nelle cellule culture.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>Dimensioni 128x86x22 mm</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F(ab')? Frammento di capra anti-coniglio IgG</td></tr><tr><td>anti-tubulina &; gamma;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>Coniglio policlonale anti-topo IgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td>Myoblast (topo)</td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>Anti-topo IgG (molecola intera) F(ab&prime;)2 frammento&ndash; Anticorpo Cy3 prodotto negli ovini</td></tr><tr><td>Dapi (4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Aquila modificata&acuto; s medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>11960044</td><td>Glicemia alta, Senza glutammina, Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>con MgCl2 e CaCl2, filtrato in modo sterile, adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>filtrato in modo sterile, Gibco</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>Fibroblasto embrionale di topo</td></tr><tr><td>Tubulina monoclonale anti-acetilata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Anticorpo monoclonale anti-tubulina acetilata prodotto in topo</td></tr><tr><td>NHLF</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td>Fibroblasti polmonari primari (umani)</td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>10.000 unità di penicillina e 10 mg di streptomicina per mL in 0,9% NaCl, Shortly-Filtered</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti cutanei</td><td>Gentilmente donato dall'Università Carolina, Facoltà di Medicina di Hradec Kr&aacute; amorevole.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slip di copertura quadrati</td><td>Thermo Scientific</td><td>22X22-1.5</td><td>Vetro borosilicato, 22x22mm, Quadrato</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200072</td><td>Filtrato Sterile, Gibco</td></tr></tbody></table>

semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1 del ciclo cellulare, che vengono riassorbite prima della mitosi. Le ciglia primarie possono essere visualizzate con metodi altamente sofisticati, tra cui la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o l'utilizzo di un software per il rilevamento automatico delle ciglia primarie. Tuttavia, per eseguire questi metodi è necessaria una colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie. Questa pubblicazione descrive un protocollo per la facile rilevazione delle ciglia primarie in vitro colorando la tubulina alfa acetilatata (axoneme) e la tubulina gamma (corpo basale). Questo protocollo di colorazione immunofluorescente è relativamente semplice e si traduce in immagini di alta qualità. Il presente protocollo descrive come quattro linee cellulari (C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti cutanei) che esprimono ciglia primarie sono state fissate, immunizzate e immagini con un microscopio fluorescente o confocale.

La colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di alta qualità. In questi esperimenti, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie erano fissati, immunosorizzati e ritrattati in un microscopio fluorescente o confocale seguendo il protocollo sopra descritto. Il cilium primario è stato rilevato utilizzando l'acetilata tubulina e γ-tubulina. La valutazione delle ciglia primarie può essere eseguita su vari livelli e qualsiasi cambiamento in questo s...

Le ciglia primarie sono strutture extracellulari associate al centriole. Il rilevamento delle ciglia primarie mediante colorazione immunofluorescente è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità. In questo protocollo, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie sono stati fissati, immunizzati e immagini in un microscopio fluorescente o confocale.

Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Questo protocollo consente un rilevamento rapido e semplice delle ciglia primarie nelle cellule coltivate, all'interno di una varietà di sforzi di ricerca. Il metodo potrebbe essere utilizzato in disordine che colpisce i corpi basali delle ciglia primarie. Questa procedura può essere applicata anche per la colorazione delle ciglia primarie nel tessuto incorporato di paraffina o per altri esperimenti in cui è necessaria la fluorescenza.Inizia con l'autoclave di 22 per 22 millimetri scivola e prepara i materiali per l'esperimento. Scongelare FBS e streptomicina penicillina e riscaldare la coltura a temperatura media-ambiente. Passare le cellule con tripside EDTA e PBS.Preparare la paraformaldeide fresca al 4%, il terreno di coltura e la soluzione di gelatina all'1%, secondo le indicazioni del manoscritto. Quindi pulire la cappa di flusso laminare con il 70% di etanolo e posizionare tutti i materiali necessari all'interno. La paraformaldeide è estremamente pericolosa.I DPI adeguati devono essere indossati in ogni momento e dovrebbero essere maneggiati solo in una cappa chimica. Dopo aver fatto crescere le cellule desiderate al 70% di confluenza, rimuoverle dall'incubatrice e posizionarle nella cappa di flusso laminare. Rimuovere il mezzo di coltura e sciacquare le cellule due volte con PBS.Aggiungere circa due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA al pallone da coltura e incubarlo a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Controllare periodicamente le cellule sul microscopio invertito per monitorare il distacco. Quando le cellule si sono staccate delicatamente riutilizzandole in 10 millilitri di mezzo di coltura, pipettando attentamente per creare una singola sospensione cellulare.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugarla a 200 volte G'per cinque minuti. Decantare il supernatante quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura e rimescolare delicatamente il pellet. Prendi 20 microlitri della sospensione cellulare e mescolala con il blu tripano con un rapporto volume uno a uno.Quindi contare le cellule usando l'emocitometria standard. Posizionare un coperchio scivolare all'interno di ogni pozzo di una piastra di sei pozza e rivestire il coperchio scivolare con due millilitri della soluzione di gelatina, che aiuterà le cellule attaccate al coperchio a scivolare. Rimuovere la gelatina e lasciare asciugare la piastra all'aria per alcuni minuti.Seme 100.000 fibroblasti in ogni pozzo e aggiungere due millilitri di mezzo di coltura. Quindi incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius, anidride carbonica al 5% e umidità relativa del 90%. Dopo l'incubazione trattare le cellule per indurre la ciliazione.Riscaldare la paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente e preparare pipette da pascolo, ABS, un contenitore di rifiuti, tubi conici da 15 milliliter, micro pipette e punte. Prendi le cellule dall'incubatrice e mettile sul banco del laboratorio. Rimuovere i supporti da ogni pozzo, lasciando il coperchio scivolare.Lavare delicatamente le cellule tre volte con due millilitri di PBS. Quindi aggiungere due millilitri del 4%PFA in ogni pozzo per fissare le celle. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il PFA e ripetere i lavaggi con PBS.Aggiungere due millilitri dello 0,5%Triton X-100 ad ogni pozzo e incubare la piastra per 15 minuti. Quindi lavare i pozzi quattro volte con PBS. Per creare la soluzione di blocco, scongelare un siero di capra per cinque minuti e diluirlo in PBS con un rapporto uno a 20.Aggiungere 150 microlitri di questa soluzione a ogni slittamento del coperchio e incubare la piastra per 20 minuti. Scongelare gli anticorpi primari per cinque minuti e diluirli separatamente in PBS, come descritto nel manoscritto testuale. Rimuovere la soluzione di blocco dagli scivolamenti del coperchio e aggiungere 150 microlitri di entrambe le soluzioni anticorpali.Quindi incubare la piastra per 60 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare delicatamente il coperchio scivola tre volte con due millilitri di PBS. Diluire Cy3 Sheep Anti-Mouse e Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit in PBS, con un rapporto da uno a 300, e aggiungere 150 microlitri di entrambe le soluzioni anticorpali secondarie allo scivolo di copertura.Preparare una soluzione DAPI funzionante diluendo 10 microlitri del materiale in 50 millilitri di PBS e aggiungere due millilitri di questa diluizione ai coperchi. Incubare il piatto per cinque minuti al buio, a temperatura ambiente. Prima di posizionare il coperchio scivola sulle diapositive, preparare due aghi, pinzette e supporti di montaggio ed etichettare tutte le diapositive.Rimuovere la soluzione DAPI dai pozzi e lavarli tre volte con PBS. Mettere una goccia di supporti di montaggio su ogni diapositiva. Utilizzare l'ago per sollevare delicatamente lo scivolamento del coperchio dal fondo del pozzo.Quindi capovolgerlo e posizionarlo delicatamente sopra la goccia di supporti di montaggio utilizzando le pinzette. Rimuovere con cura eventuali bolle. Proteggere le diapositive dalla luce e conservarle durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo utilizzare un microscopio fluorescente o confocale con un alto ingrandimento per visualizzare le ciglia primarie. Questo protocollo è stato utilizzato per correggere l'immunosostenibile e l'immagine di varie linee cellulari che esprimono ciglia primarie. Quando i mioblasti di topo sono stati esposti a radiazioni ionizzanti a varie dosi, si è scoperto che dosi più elevate inducono la comparsa di più ciglia primarie.Mentre basse dosi hanno portato alla comparsa di singole ciglia primarie. Allo stesso modo, quando i fibroblasti polmonari umani sono stati irradiati a bassa dose, singole ciglia primarie sono state rilevate dall'immunofluorescenza. Un aumento della ciglia primaria è stato osservato nei fibroblasti embrionali di topo che sono stati affamati, dimostrando che lo stress metabolico influisce sugli incidenti delle ciglia primarie.Quando i fibroblasti cutanei sono stati trattati con 120 doxorubicina nanomolare, hanno espresso un singolo cilio primario. Dosi più elevate inducono la comparsa di ciglia primarie multiple. I fibroblasti trattati con 1,25 taxolo nanomolare hanno anche espresso un singolo cilio primario.Ma ciglia multiple non sono state rilevate dopo il trattamento con dosi più elevate. Quando si apre questo protocollo assicurarsi di seguire tutte le normative DPI. Tieni presente le esigenze di coltura della tua linea cellulare preferita e scegli attentamente i tuoi anticorpi.Questa procedura non può essere seguita direttamente da altre procedure, poiché le celle sono irrecuperabili. Al contrario, gli esperimenti paralleli dovrebbero essere programmati.

simple-detection-of-primary-cilia-by-immunofluorescence

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analisi delle interazioni delle nanoparticelle con sottopopolazioni di cellule immunitarie definite mediante citometria di flusso.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Le ciglia dei neuroni sensoriali olfattivi contengono proteine della cascata di trasduzione del segnale, ma un'analisi spaziale dettagliata della loro distribuzione è difficile nelle criosezioni. Descriviamo qui un approccio ottimizzato per la marcatura dell'intera montatura e la visualizzazione en face delle proteine ciliari.

Tutta Monte Etichettatura del Cilia nel Main olfattivo Sistema di Mice

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla rilevazione immunoistologica della proteina c-FOS, una tecnica classica utilizzata per l'identificazione di popolazioni neuronali coinvolte in specifiche risposte fisiologiche in vivo ed ex vivo.

La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Recentemente abbiamo mappato le posizioni spaziali (3D) tridimensionale delle vie di trasporto per varie proteine dispostamento all'interno ciliari in cellule vive. Qui questo dettagli di carta la messa a punto sperimentale, il processo di campioni biologici e l'analisi dei dati per la fluorescenza 3D Super-resolution imaging approccio appena applicati in live ciliari.

Applicazione di microscopia di velocità ad alta velocità super-risoluzione in Live cilio primario

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

L'uso dell'intelligenza artificiale (Ai) per analizzare le immagini sta emergendo come un approccio potente, meno parziale e rapido rispetto ai metodi comunemente usati. Qui abbiamo addestrato Ai a riconoscere un organello cellulare, ciglia primarie e analizzare proprietà come la lunghezza e l'intensità della colorazione in modo rigoroso e riproducibile.

Approcci di intelligenza artificiale per valutare le ciglia primarie

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Qui, presentiamo un protocollo di elettroporazione riproducibile in vitro per la manipolazione genetica dei precursori delle cellule del granulo cerebellare primario (GCP) che è economico, efficiente e praticabile. Inoltre, questo protocollo dimostra anche un metodo semplice per lo studio molecolare delle vie di segnalazione primarie del riccio cilio-dipendenti nelle cellule GCP primarie.

Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo

L'analisi videomicroscopica ad alta velocità è uno strumento relativamente facile da eseguire, veloce, economico e, in mani esperte, uno strumento considerevolmente affidabile per la diagnostica di prima linea della discinesia ciliare primaria, che dovrebbe essere disponibile in ogni centro coinvolto nella diagnostica e nel trattamento di gravi malattie polmonari.

Analisi video al microscopio ad alta velocità per la diagnosi di prima linea della discinesia ciliare primaria

Questo metodo descrive lo sfruttamento del segnale endogeno in un modello murino transgenico ARL13B-CENTRIN-2 per visualizzare le ciglia primarie in situ, in tre dimensioni su ampie aree di tessuto mineralizzato, dalla raccolta dei tessuti all'analisi dell'organizzazione delle ciglia. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tipi di tessuti.

Imaging volumetrico e analisi delle ciglia primarie nel tessuto muscoloscheletrico utilizzando il modello murino ARL13B-CENTRIN-2

I disturbi della laminopatia spesso portano a cambiamenti nell'involucro nucleare, che possono causare blebbing e perdite nucleari. Questo studio presenta un metodo di immunofluorescenza per visualizzare la lamina nucleare insieme al DNA a doppio filamento (dsDNA), fornendo un mezzo per valutare la struttura e l'integrità nucleare nelle cellule di mammifero.

Rilevamento del blebbing nucleare e della perdita di DNA nelle cellule di mammifero mediante immunofluorescenza

Impara il rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza su fibroblasti. Questo metodo consente imaging di alta qualità e studi sui disordini delle basali corporee.

Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza

Esplora altri video