Infezione delle larve di zebrafish con spore di Aspergillus per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno

Questo protocollo dimostra un modello di infezione da aspergillus larvale di pesce zebra, che possiamo utilizzare per studiare le risposte immunitarie innate a questo fungo. Il vantaggio principale del modello larvale di zebrafish è che possiamo visualizzare le interazioni tra le cellule immunitarie e i patogeni e la progressione dell'infezione all'interno di un animale ospite vivo durante un'infezione di più giorni. I risultati di questo modello possono essere applicabili alla scoperta di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento dell'aspergillosi invasiva nei pazienti immunocompromessi.

La microiniezione di spore nelle larve di pesce zebra è una tecnica difficile che richiede una notevole pratica prima di poter ottenere risultati coerenti e riproducibili. Per eseguire le microiniezioni, utilizzare il set up fornito con un iniettore di pressione, un'unità di pressione vac, un interruttore a pedale, un supporto per micropipette, un micromanipolatore e un supporto magnetico e una piastra. Il tutto collegato ad una fonte di aria compressa.

Aprire la valvola dell'aria compressa. E accendi il microiniettore. Impostare la pressione a circa 25 psi, il rinforzo a 60 millisecondi e l'unità di pressione vac a 1 psi.

Utilizzare una punta per pipetta con micro caricatore per caricare l'ago per microiniezione con tre o cinque microlitri di PBS o sospensione di spore con rosso fenolo. Quindi montare l'ago sul micromanipolatore. L'Aspergillus fumigatus è un patogeno opportunista dell'uomo.

Esiste il rischio di puntura della pelle con l'ago carico. L'ago deve essere fissato molto saldamente al microiniettore e i ricercatori devono sempre indossare guanti e prestare molta attenzione ai movimenti della mano attorno all'ago per evitare la perforazione. Posizionare il micromanipolatore in modo che l'estremità dell'ago sia visibile sotto lo stereomicroscopio al minimo ingrandimento.

Zoom fino a 4x, mantenendo l'ago in vista. Quindi utilizzare una pinza affilata per tagliare l'estremità dell'ago. Premere il pedale di iniezione per visualizzare la dimensione della gocciolina.

E continua a tagliare l'ago fino a quando non escono circa tre nanolitri di sospensione di spore. Quando è pronto, spostare il micromanipolatore e l'ago in modo che non siano d'intralcio per evitare di colpire accidentalmente l'ago mentre si sistemano le larve sulla piastra di iniezione. Versare la tricaina E3 dalla piastra di iniezione.

E trasferire circa 24 larve anestetizzate di due giorni sulla piastra con la minor quantità possibile di E3. Quindi, disponi le larve in base alla direzione in cui sono rivolte, posizionando tutte le larve rivolte a destra in una fila e tutte rivolte a sinistra in una fila sotto. Con il microscopio impostato sull'ingrandimento più basso, riportare indietro il micromanipolatore, in modo che l'ago sia vicino alle larve con un angolo di 30-60 gradi.

Ingrandisci l'ingrandimento massimo. E usa le manopole di regolazione fine per regolare ulteriormente la posizione dell'ago. Iniettare la sospensione di spore nel liquido accanto alle larve per verificare che 30-70 spore escano dall'ago.

Quindi sposta la piastra in modo che l'ago sia direttamente sopra e posizionato vicino alle prime larve. A partire dalle larve che sono rivolte verso l'ago. Inserire l'ago attraverso il tessuto attorno alla vescicola otica e perforarlo nel ventricolo del rombencefalo, muovendo la placca secondo necessità per ottenere il giusto orientamento della larva.

Verificare visivamente che l'estremità dell'ago si trovi al centro del ventricolo rombencefalico. Quindi premere il pedale per iniettare le spore e ritrarre delicatamente l'ago. Dopo aver iniettato tutte le larve in entrambe le file, spostare nuovamente l'ago.

E ingrandisci a un ingrandimento inferiore. Il colorante rosso fenolo dovrebbe essere ancora visibile nel rombencefalo di ogni larva. Smaltire le larve con iniezioni non riuscite e trasferire le larve rimanenti in una capsula di Petri lavandole via dalla piastra con E3 fresco. Sciacquare la larva due volte con E3 e assicurarsi che si riprenda dall'anestesia.

Immediatamente dopo l'iniezione, trasferire otto larve in singole provette da 1,7 millilitri e sopprimerle. Preparare 1 ml di PBS con ampicillina e kanamicina. Rimuovere quanto più liquido possibile dai tubi con le larve.

Quindi aggiungere 90 microlitri di PBS con antibiotici. Omogeneizzare le larve in un TissueLyser a 1800 oscillazioni al minuto, per sei minuti. Quindi, girali verso il basso a 17.000 volte G per 30 secondi.

Pipettare la sospensione omogeneizzata da ciascuna provetta al centro di una piastra GMM etichettata e distribuirla utilizzando uno spandiconcime monouso a forma di L. Facendo attenzione a non spargere contro il cerchio. Incubare le piastre capovolte a 37 gradi Celsius per due o tre giorni.

Quindi, conta il numero di colonie formate. Dividere le restanti larve iniettate in due piastre da 3,5 millimetri. Uno per il trattamento farmacologico e uno per il controllo.

Rimuovere quanto più liquido possibile e aggiungere E3 con il controllo del veicolo a un piatto. E l'E3 con il trattamento di interesse all'altro. Utilizzare una pipetta per trasferire ogni larva in un pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.

E monitora la loro sopravvivenza per sette giorni. Il giorno dell'imaging, preparare una capsula di Petri da 3,5 millimetri con PTU 100 micromolari e una con tricaina E3. Aggiungere la tricaina E3 nelle camere di un dispositivo Z-wedge E utilizzare una micropipetta P100 per rimuovere le bolle d'aria dalle camere e dal canale di contenimento.

Quindi rimuovere tutta la tricaina E3 in eccesso all'esterno delle camere. Pipettare una larva e trasferirla nel piatto con l'E3 PTU. Quindi trasferiscilo nella tricaina E3, con meno liquido possibile.

Dopo 30 secondi, trasferire le larve anestetizzate nella camera di carico del dispositivo di ferita e intrappolamento. Rimuovere la tricaina E3 dalla camera di ferita e rilasciarla nella camera di carico per spostare la coda delle larve nel canale di restrizione. Assicurati che la larva sia posizionata sul lato laterale, dorsale o dorsolaterale in modo che il romboencefalo possa essere ripreso con una lente dell'obiettivo invertita.

Dopo aver eseguito l'imaging della larva con un microscopio confocale, rilasciare la tricaina E3 nella camera di ferita per spingere la larva dal canale di contenimento nella camera di carico. Raccogli la larva e trasferiscila nuovamente nel piatto con la tricaina E3. Quindi trasferirlo nella piastra con E3 PTU con meno liquido possibile.

Sciacquarlo in PTU e trasferirlo nuovamente nella piastra a 48 pozzetti. Le spore di Aspergillus sono state microiniettate nel rombencefalo di larve di zebrafish, ed è stato monitorato l'esito dell'infezione. Pochissima morte è stata osservata nelle larve di tipo selvatico, con l'80-100% delle larve sopravvissute all'intero esperimento.

Una significativa diminuzione della sopravvivenza è stata osservata nelle larve immunosoppresse. Quando sono state quantificate le unità formanti colonie da larve di tipo selvatico infette, è stata osservata la persistenza delle spore e la lenta eliminazione nel tempo. Il numero di spore sopravvissute a uno, due, tre, cinque e sette giorni dopo l'infezione è stato normalizzato al numero di spore iniettate, al fine di confrontare la persistenza e la clearance tra le repliche.

Quando i macrofagi sono stati marcati, il raggruppamento dei microfagi in circa il 50% delle larve è stato tipicamente osservato a partire da due o tre giorni dopo l'infezione. Il reclutamento dei neutrofili è stato ritardato, verificandosi principalmente dopo una germinazione fungina. Mentre la carica fungina persisteva per l'intero esperimento nella maggior parte delle larve.

La clearance è stata osservata in alcuni a cinque giorni dall'infezione. In un altro sottogruppo di larve è stata osservata la disseminazione fungina in aree al di fuori del rombencefalo. L'area intorno alla vescicola otica è uno dei luoghi in cui è stata trovata questa disseminazione.

La germinazione fungina è stata in genere osservata entro cinque giorni nel 60% delle larve. L'area del cluster dei fagociti, il reclutamento dei macrofagi e il reclutamento dei neutrofili variavano nel tempo in tutte le larve. Con alcuni trend in aumento durante l'esperimento e altri che si risolvono nel tempo.

Questa procedura può essere combinata con la manipolazione genetica del pesce zebra, come con CRISPR, per determinare la necessità di specifiche vie dell'ospite in una risposta immunitaria innata di successo all'aspergillus. Questo protocollo ha permesso la visualizzazione delle interazioni delle cellule immunitarie innate dell'aspergillus in tempo reale, in ospiti vivi e intatti.