Un modello epiteliale bronchiale interfaccia aria-liquido per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle trasportate dall'aria per i test di tossicità
13 maggio 2020
Descritto è il metodo di coltura cellulare e di esposizione di un modello bronchiale in vitro per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle per le prove di tossicità.
Questo protocollo descrive come coltivare ed esporre le cellule epiteliali bronchiali umane attraverso l'aria. Questo è un modello più realistico per studiare l'esposizione del polmone alle particelle inalate. Le cellule polmonari si sono preparate con questi metodi, per assomigliare all'ambiente reale nel polmone. Le cellule produrranno muco, formeranno una barriera stretta, rimanendo vitali per diverse settimane. Questo metodo può essere utilizzato per studiare gli effetti tossici delle particelle sospese nell'aria. Può anche essere utilizzato per studiare le malattie infettive delle vie aeree e i farmaci assunti per inalazione. Quando provi questo protocollo per la prima volta, tieni presente che la generazione di un agile richiede conoscenze specialistiche. Richiede inoltre un'attrezzatura dedicata per la misurazione. Iniziare diluendo le cellule in terreno di coltura cellulare preriscaldato o CCM, a una concentrazione di 500.000 cellule per millilitro per inserti a 6 pozzetti. E 250.000 cellule per millilitro per inserti a 12 pozzetti. Posizionare una piastra per colture cellulari con inserti in condizioni asettiche e riempire il lato laterale basale con CCM preriscaldato.Dopo aver miscelato la sospensione cellulare, pipettarla sopra la membrana nell'inserto per colture cellulari. Coprire la piastra e incubarla a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Coltivare le cellule in condizioni sommerse per sette giorni, per consentire loro di raggiungere la confluenza, cambiando il CCM ogni due o tre giorni. Per misurare la resistenza elettrica transepiteliale, utilizzare un voltohmmetro epiteliale carico, integrato con un set di elettrodi a bacchetta. Pulire gli elettrodi con etanolo al 70%. Posizionare l'elettrodo più lungo nel terreno di coltura esterno, fino a toccare il fondo della piastra. E l'elettrodo più corto nel fluido, senza toccare la membrana. Iniziare a raccogliere le misure sull'inserto vuoto senza celle. Attendere che la misurazione si stabilizzi e annotare la resistenza in ohm. Questa misura è la resistenza della membrana dell'inserto senza celle o resistenza del bianco. Ripetere la misurazione per ogni inserto e sottrarre la resistenza del grezzo per ottenere la resistenza reale e moltiplicare per la superficie dell'inserto. Rimuovere il fluido dal lato apicale degli inserti e aggiungere il CCM preriscaldato sul lato basolaterale del pozzetto. Il fluido deve toccare la membrana dal basso, ma non fuoriuscire sulla parte superiore dell'inserto. Coltiva le cellule all'interfaccia aria-liquido nell'incubatore, a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per sette giorni. Cambiare il mezzo basolaterale ogni due o tre giorni. Poco prima dell'esposizione alle particelle, preparare una sospensione di nanoparticelle all'1%. Pre-bagnare le NP con etanolo al 96%. Aggiungere acqua pura fino a una concentrazione finale dell'1% di NPs.Mettere la fiala in un becher sul ghiaccio. Sonicare la sospensione per 16 minuti, aggiungere una mescolata al flacone con la dispersione, quindi collegare il flacone a una pompa peristaltica tramite un tubicino e regolare il flusso a 25 millilitri all'ora. Un giorno prima dell'esposizione, accendere la stazione di esposizione automatica o AES e lasciare che l'armadio raggiunga una temperatura di 37
Panoramica
Questo studio si concentra sullo sviluppo di un modello bronchiale in vitro per simulare esposizioni ripetute per inalazione a particelle aerodisperse ai fini della valutazione della tossicità. Le cellule epiteliali bronchiali umane coltivate mostrano una lunga vitalità e una produzione realistica di muco, rendendo il modello adatto a studi tossicologici e alla ricerca su malattie infettive.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Tossicologia
- Biologia respiratoria
- Modelli in vitro
Sfondo
- La necessità di modelli di esposizione polmonare realistici
- Importanza dello studio delle particelle inalate
- Applicazioni nella ricerca sulla somministrazione di farmaci e sulle malattie infettive
Metodi Utilizzati
- Tecniche di coltura cellulare per cellule epiteliali bronchiali umane
- Condizioni di coltura all'interfaccia aria-liquido
- Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale
Risultati principali
- Le cellule formano una barriera stretta e producono muco
- La vitalità è mantenuta per diverse settimane in condizioni controllate
- Il metodo è stato convalidato per l'uso nelle valutazioni tossicologiche
Conclusioni
- Il modello sviluppato simula efficacemente l'esposizione polmonare a particelle inalate
- Implicazioni significative per i test di tossicità e la ricerca respiratoria
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I modelli realistici in vitro di epitelio bronchiale sono fondamentali per test predittivi di tossicità da inalazione e per la ricerca sul rilascio di farmaci a livello respiratorio. Il sistema air-liquid interface (ALI) con cellule Calu-3 consente studi di esposizione ripetuta a basse dosi che riproducono da vicino le condizioni delle vie aeree umane, offrendo una maggiore affidabilità traslazionale nella valutazione precoce di nuovi composti. Questo approccio risponde alla necessità di modelli fisiologicamente rilevanti e riproducibili nei flussi di lavoro biotecnologici respiratori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette la riduzione del rischio meccanicistico degli effetti di composti inalati sull'epitelio delle vie aeree.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio mantenendo giunzioni strette e produzione di muco per periodi prolungati.
- Facilita una valutazione predittiva affidabile della tossicità respiratoria e dei profili di sicurezza.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un sistema validato e riproducibile per la misurazione quantitativa dell'integrità della barriera epiteliale.
- Permette la standardizzazione dei saggi per esposizioni ripetute a basse concentrazioni di particelle.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti di composti aerodispersi in condizioni di flusso continuo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli delle vie aeree pertinenti alle malattie per studi traslazionali sui biomarcatori.
- Garantisce continuità dallo screening in vitro alla tossicologia preclinica per inalazione.
- Riduce il rischio di fallimento in fasi avanzate modellando scenari di esposizione realistici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello bronchiale ALI si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica per i farmaci respiratori e la tossicologia da inalazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione della barriera delle vie aeree e sulla tossicità delle particelle.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili della resistenza transepiteliale e della vitalità.
- Analisi: Permette il monitoraggio continuo della concentrazione di esposizione e della dose erogata.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a studi preclinici di inalazione con endpoint rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata adattabile a diversi studi su particelle aerodisperse e farmaci.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei test di tossicità respiratoria.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità per protocolli di esposizione ripetuti.
- Valore strategico: Perfeziona le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) e l'efficienza del capitale nello sviluppo del portafoglio respiratorio.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio di composti e formulazioni inalati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare ad interfaccia aria-liquido e nella misurazione della barriera epiteliale.
- Necessita di strumentazione dedicata per l'esposizione a flusso continuo e il monitoraggio della resistenza.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per i protocolli di esposizione e l'analisi dei dati.
- Adattabile a diversi tipi e concentrazioni di particelle aerodisperse, entro i limiti del modello.
- Dipende dal mantenimento della vitalità cellulare e dell'integrità delle giunzioni strette durante periodi prolungati di coltura.
