Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Ciao, sono Chris Glembotski. Sono professore di medicina presso l'Università dell'Arizona College of Medicine di Phoenix. E io sono il direttore del Translational Cardiovascular Center, anch'esso situato qui a Phoenix.

Oggi vorrei presentarvi due persone che dimostreranno la nostra nuova tecnica, il Dr. Erik Blackwood, il mio senior postdoctoral fellow e docente in formazione, e la ricercatrice senior Miss Alina Bilal. Gli attuali protocolli di isolamento dei miociti cardiaci limitano la quantità e la vitalità delle cellule in coltura, creando un'impasse sperimentale per approfondire la nostra comprensione della fisiologia cardiaca e della fisiopatologia. Questo protocollo mira non solo ad accelerare il processo di isolamento delle cellule cardiache murine adulte, ma anche ad aumentare la resa cellulare e la vitalità delle cellule cardiache atriali e ventricolari contemporaneamente da un singolo cuore di topo.

Questa tecnica ha profonde implicazioni per la scoperta terapeutica e per il fatto che malattie come la fibrillazione atriale possono essere meglio caratterizzate a livello specifico del tipo di cellula, consentendo l'identificazione di bersagli terapeutici. Si raccomanda che le persone senza precedenti esperienze di microchirurgia pratichino ampiamente le fasi di espianto aortico ascendente e incannulamento prima di tentare il protocollo di isolamento completo. Inizia usando le forbici per praticare un'incisione cutanea sulla linea mediana per aprire rapidamente il torace di un topo nero 6J C57 anestetizzato di 10 settimane da metà addome alla mascella.

Entrare nel peritoneo e liberare il diaframma mediante dissezione smussata. Tagliare la gabbia toracica con incisioni lungo la parete toracica sulla faccia laterale di entrambi i lati e tagliare via le connessioni fibrose tra il cuore e la parete toracica. Dopo la completa rimozione della gabbia toracica, utilizzare piccole pinze e forbici per sollevare delicatamente il cuore dall'apice esponendo l'aspetto posteriore del cuore.

Per espiantare il cuore, sezionare immediatamente l'arteria innominata sull'aorta ascendente e posizionare immediatamente il cuore in un mezzo di perfusione cardiaca ghiacciato. Sezionare rapidamente il tessuto rimanente per esporre l'aorta ascendente e utilizzare pinze e forbici da microdissezione per liberare l'area circostante l'aorta dal tessuto in eccesso. Utilizzare una pinza a punta fine per posizionare l'aorta pulita di due millimetri su una cannula di perfusione e fissare la cannula con una sutura di seta 5-0.

Lavare il cuore cannulato con un mezzo di perfusione cardiaca a una velocità di flusso di tre millilitri al minuto per quattro minuti prima di passare al tampone di digestione per 15-17,5 minuti. Durante gli ultimi minuti della perfusione, raccogliere otto millilitri del flusso del tampone di digestione e trasferire il cuore dalla cannula in un piatto di coltura di plastica da 60 millimetri, quindi rimuovere il tessuto in eccesso e immergere il cuore in 2,5 millilitri di tampone di digestione. Per l'isolamento delle cellule atriali, sezionare gli atri lontano dal cuore e posizionare gli atri in un piatto di coltura di plastica da 30 millimetri contenente 750 microlitri di tampone digestivo.

Usando le forbici chirurgiche a punta fine, tritare e stuzzicare gli atri prima di sezionare ulteriormente il tessuto con una pinza fine senza agitare o separare le fibre muscolari. Utilizzando un puntale per pipetta di trasferimento sterile, continuare a mescolare delicatamente e dissociare il tessuto per 15 minuti. Ogni cinque minuti, osservare la dissociazione dei miociti atriali sotto l'obiettivo 10X di un microscopio a campo chiaro.

Man mano che il tessuto viene ulteriormente digerito, continuare a mescolare e dissociare delicatamente il tessuto utilizzando una punta per pipetta di trasferimento sterile con pori di dimensioni inferiori prima di trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da microcentrifuga da due millilitri. Sciacquare la piastra da 30 millimetri con 750 microlitri di tampone di arresto dei miociti a 37 gradi Celsius e combinare il tampone con la sospensione cellulare. Lasciare sedimentare i miociti atriali per gravità e agitazione delicata per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quando si è formato un pellet visibile, centrifugare la sospensione cellulare e trasferire il surnatante non contenente miociti in una provetta conica in polipropilene da 15 millilitri senza disturbare il pellet del miocita atriale. Centrifugare la frazione non miocitaria e risospendere il pellet non miocitario in 10 millilitri di DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello. Dopo il conteggio, posizionare le cellule non miocitarie alla densità sperimentale appropriata per l'analisi a valle, quindi risospendere il pellet di miocita atriale isolato alla concentrazione sperimentale appropriata per la semina su piastre di coltura rivestite di laminina.

Per l'isolamento delle cellule ventricolari, tritare il tessuto cardiaco ventricolare come appena dimostrato per il campione di tessuto atriale e trasferire la sospensione cellulare risultante in una provetta conica in polipropilene da 15 millilitri contenente 2,5 millilitri di tampone di arresto dei miociti a 37 gradi Celsius. Sciacquare la piastra di dissezione con 2,5 millilitri di tampone di arresto dei miociti a 37 gradi Celsius e combinare il lavaggio con la sospensione cellulare. Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, continuare a mescolare delicatamente e dissociare il tessuto per quattro minuti.

Al termine dell'incubazione, utilizzare un'aliquota di 10 microlitri delle cellule per verificare la presenza di miociti a forma di bastoncello. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro di nylon sterile da 100 microlitri in una provetta conica di polipropilene da 50 millilitri e utilizzare due millilitri del tampone di digestione precedentemente raccolto per lavare le cellule rimanenti dal filtro di nylon sterile. Lasciare sedimentare i miociti ventricolari per gravità per sei minuti con una leggera agitazione fino a quando non si forma una pallina visibile sul fondo del tubo.

Utilizzando un puntale per pipetta sterile, trasferire il surnatante non contenente miociti in una provetta conica in polipropilene da 15 millilitri senza disturbare il pellet di miociti ventricolari e centrifugare la frazione non miocitaria. Risospendere il pellet non miocitario in 10 millilitri di DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello per il conteggio e preparare le cellule alla concentrazione appropriata per la loro analisi a valle, quindi risospendere i miociti ventricolari isolati in due millilitri di tampone di arresto dei miociti due per il conteggio. Per impostare un paradigma graduale di reintroduzione del calcio, aggiungere 50 microlitri di cloruro di calcio da 10 millimolari alla sospensione di cellule miocitarie ventricolari con un'accurata miscelazione per un'incubazione di quattro minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, aggiungere altri 50 microlitri di cloruro di calcio da 10 millimolari alle cellule mescolando per un'altra incubazione di quattro minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trattare le cellule con un'incubazione di quattro minuti con 100 microlitri di cloruro di calcio da 10 millimolari e un'incubazione di quattro minuti con 80 microlitri di cloruro di calcio da 10 millimolari. Dopo l'ultima incubazione, risospendere i miociti ventricolari trattati con calcio in un volume appropriato di terreno di placcatura per miociti ventricolari in base all'analisi a valle pianificata e seminare le cellule su piastre di coltura rivestite di laminina.

Dopo un'ora, sostituire il surnatante con un terreno di mantenimento dei miociti ventricolari integrato con 25 micromolari di Blebbistatin. La troponina T del muscolo cardiaco è un marcatore dei miociti cardiaci ed è fortemente espressa sia nelle colture di miociti cardiaci atriali che ventricolari. Al contrario, il peptide natriuretico atriale e la catena leggera della miosina due sono espressi in modo robusto e specifico rispettivamente nelle colture di miociti cardiaci atriali e ventricolari.

I marcatori dei fibroblasti sono espressi esclusivamente in colture non miocitarie isolate sia dalla camera atriale che da quella ventricolare. L'immunocolorazione dei miociti atriali e ventricolari di topo adulto per il marcatore dei tubuli T diidropiridina e il recettore della rianodina dimostrano l'integrità dei tubuli T durante l'isolamento e la coltura a lungo termine. Il pattern di striatura sarcomerica può essere utilizzato per valutare la purezza e la vitalità di miociti cardiaci isolati in combinazione con la morfologia a bastoncello e la colorazione nucleare con TO-PRO-3.

Come previsto, i miociti cardiaci ventricolari sono grandi, con una lunghezza media di circa 150 micrometri, mentre i miociti cardiaci atriali hanno una media di circa 75 micrometri. Inoltre, all'analisi di immunocolorazione, i miociti cardiaci atriali mostrano una robusta espressione del peptide natriuretico atriale in un pattern di colorazione caratteristico della localizzazione al reticolo endoplasmatico e ai granuli secretori. Mentre i miociti atriali secernono peptide natriuretico atriale in condizioni basali, la secrezione aumenta in risposta ai secretagoghi.

Inoltre, i miociti cardiaci atriali secernono peptide natriuretico atriale e la co-secrezione elabora solo una parte dell'ormone dal suo stato precursore al peptide prodotto. Gli errori evitabili più comuni includono non mantenere l'animale calmo prima del sacrificio, non evacuare le bolle d'aria dal sistema di perfusione e il chirurgo stesso non mantenere la calma. Successivamente a questa procedura, è possibile eseguire qualsiasi procedura sperimentale comune, tra cui il dosaggio dei parametri elettrofisiologici e di manipolazione del calcio, l'immunocitochimica, la risposta ipertrofica e gli studi di segnalazione e gli studi di riperfusione ischemica simulata.