Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Questo protocollo può essere utilizzato per indagare se gli anestetici volatili interrompono alcune sinossi più di altre, per determinare se i loro effetti sono di tipo cellulare o come pathway specifici e per determinare quali effetti si verificano a livello di popolazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la specificità con cui possiamo valutare gli effetti degli anestetici volatili. Possiamo mirare a percorsi e tipi di cellule specifici nell'attività simultanea della popolazione con saggi.

Inizia preparando il blocco di tessuto per il sezionamento. Solleva delicatamente il cervello dalla cavità cranica e posizionalo sulla carta da filtro. Fai un taglio lungo il piano sagittale del cervello parallelo alla linea mediana e posiziona il blocco di tessuto su questo piano sagittale.

Guida la carta da filtro sul modello di blocco e allinea il cervello con il contorno del modello sottostante. Eseguire un taglio parallelo nel piano coronale come indicato dalle linee sulla dima, aggiungendo una piccola goccia di slicing aCSF per mantenere la carta da filtro bagnata se necessario. Posizionare il blocco di tessuto a quattro gradi Celsius affettando aCSF e applicare una piccola quantità di colla sullo stadio del campione ghiacciato.

Sollevare il blocco di tessuto dall'aCSF per affettare e rimuovere la soluzione in eccesso con un angolo di un asciugamano assorbente. Incollare il piano coronale posteriore del blocco di tessuto allo stadio del campione con la superficie dorsale del cervello rivolta verso la lama di zaffiro. Raccogli fette di cervello coronale spesse 500 micrometri e posizionale su una rete di nylon a 34 gradi Celsius affettando un CSF.

Lasciare che il contenitore raggiunga la temperatura ambiente. Per preparare sacche sperimentali di aCSF con isoflurano disciolto, aggiungere 600 millilitri di aCSF sperimentale e 600 millilitri di miscela di gas al 95% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica a una sacca vuota di gas politetrafluoroetilene. Etichettare questo controllo della borsa.

Aggiungere 300 millilitri di aCSF sperimentale a un'altra sacca di gas politetrafluoroetilene ed etichettare questa sacca con isoflurano. Procedere con la preparazione della sacca di isoflurano secondo le indicazioni del manoscritto. Configura i protocolli di simulazione della luce assegnando in modo casuale le forme d'onda a ciascun profilo.

Ogni profilo con la forma d'onda assegnata corrisponde a un impulso di trigger da un ingresso TTL digitale o da una prova. Al termine, salvare la sequenza del profilo. Per posizionare la sonda multicanale nel vetrino di tessuto cerebrale ex vivo, perfondere l'aCSF sperimentale a bolle da tre a sei millilitri al minuto e trasferire la fetta di cervello contenente l'area di interesse sulla griglia a maglie nella camera di perfusione del microscopio.

Ancorare la fetta di cervello con un'arpa di platino. Ruotare la griglia a maglie in modo che la linea dei contatti degli elettrodi sull'estremità distale della sonda multicanale sia approssimativamente perpendicolare alla superficie di pelatura. In condizioni di illuminazione ad ampio campo e controllo preciso del micromanipolatore, abbassare la sonda multicanale verso la superficie della fetta.

Attivare il cubo filtrante appropriato per la visualizzazione della proteina reporter fluorescente espressa nei terminali assonici delle afferenze corticali. Se necessario, ruotare la fetta per allineare più precisamente la sonda con la superficie di pelatura. Posizionare la sonda appena sopra il piano della fetta a 200 micrometri dalla posizione finale del bersaglio lungo l'asse x, lasciando almeno un canale al di fuori dell'area di tessuto da registrare.

Inserire lentamente la sonda nella fetta lungo il suo asse longitudinale. Per ridurre al minimo i danni al tessuto, far avanzare la sonda solo nella misura in cui le punte affilate sono appena visibili sotto la superficie del tessuto. Passa dalla sorgente aCSF sperimentale alla soluzione di controllo in busta e identifica la cella marcata in fluorescenza per la registrazione mirata del patch clamp.

Limitare l'apertura al diametro più piccolo e innestare l'obiettivo ad immersione in acqua ad alta potenza, facendo attenzione a evitare il contatto tra la sonda multicanale e la lente dell'obiettivo. Metti a fuoco il tessuto. Centrare la luce su un'area di tessuto adiacente ma non sovrapposta alla sonda multicanale.

Attivare il set di filtri appropriato per consentire l'imaging delle cellule che esprimono il marcatore fluorescente Cre-dipendente. Sollevare la lente dell'obiettivo per creare ampio spazio per l'abbassamento di una pipetta per cerotto. Caricare una pipetta patch con soluzione interna e montarla sul portaelettrodo.

Utilizzare una siringa da un millilitro per applicare una pressione positiva corrispondente a circa 0,1 millilitri d'aria. Abbassare la pipetta del cerotto nella soluzione mettendo a fuoco la punta sotto la guida visiva e ottenere la registrazione dell'intera cellula dalla cellula bersaglio. Gli animali utilizzati in questo protocollo esprimevano la proteina reporter fluorescente tdTomato in interneuroni positivi alla somatostatina o alla parvalbumina.

Questi interneuroni sono stati presi di mira per il patch clamping sotto guida visiva con il cubo filtrante appropriato inserito. Potenziali postsinaptici sono stati osservati negli interneuroni in risposta a un treno di quattro impulsi di luce da due millisecondi. Sono stati registrati anche i potenziali di campo locali.

La densità della sorgente attuale e l'attività multi-unità sono state estratte dai potenziali di campo locali. L'ampiezza dei pozzi di corrente estratti dalla densità della sorgente di corrente aumentava in funzione dell'intensità della luce. Un'equazione logistica non lineare a tre parametri è stata adattata ai dati per i confronti tra i percorsi.

Anche l'ampiezza del potenziale postsinaptico aumenta con l'ampiezza del dissipatore di corrente. Le risposte sinaptiche agli input talamocorticali e cortico-corticali sono state misurate durante le condizioni di controllo, isoflurano e recupero. Le risposte postsinaptiche della somatostatina e degli stimoli cortico-corticali e i pozzi di corrente evocati sono stati soppressi in condizioni di isoflurano.

Quando si preparano le fette di cervello, mantenere la salute del tessuto è fondamentale. È importante mantenere il tessuto fresco durante la procedura di affettatura, lavorando rapidamente senza danneggiare il tessuto. Le registrazioni extracellulari multicanale possono essere post-elaborate in vari modi.

Ad esempio, il filtraggio passa-alto del segnale a banda larga isola l'attività di picco della popolazione, mentre i calcoli della densità della sorgente di corrente evidenziano l'attività sinaptica. Insieme, queste tecniche ci hanno permesso di esplorare gli effetti dell'anestetico su specifici componenti isolati dei circuiti corticali, fornendo informazioni sui meccanismi alla base della perdita di coscienza in vivo.