Name: Misurazione dellassorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Impara a misurare l'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico isolato di topo. Questo metodo es vivo permette di valutare con precisione il metabolismo glucidico muscolare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Danish Council for Independent Research - Medical Sciences (FSS8020-00288B) e della Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046). Questo lavoro è stato anche supportato da una borsa di ricerca a Rasmus Kjøbsted della Danish Diabetes Academy, che è finanziata dalla Novo Nordisk Foundation, numero di sovvenzione NNF17SA0031406. Gli autori desiderano ringraziare Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Dipartimento di Nutrizione, Esercizio e Sport, Facoltà di Scienze, Università di Copenaghen) per la loro assistenza tecnica qualificata.

Gli autori non hanno nulla da rivelare

La regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico è importante per preservare la salute generale1. Pertanto, l'indagine sull'assorbimento del glucosio muscolare spesso funge da lettura primaria quando si valutano vari interventi che alterano la salute. Qui descriviamo un metodo ex vivo per misurare l'assorbimento di glucosio nel soleo isolato e incubato e nel muscolo EDL dai topi in risposta all'insulina e alle contrazioni indotte elettricamente. Il metodo è rapido e af...

Il muscolo scheletrico possiede la capacità di estrarre grandi quantità di glucosio dallo spazio extracellulare in risposta all'insulina e all'esercizio fisico. Questo aiuta a mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo e assicura l'approvvigionamento di glucosio durante i periodi di elevata domanda di energia. Poiché la regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio nei muscoli scheletrici ha dimostrato di essere importante per la salute generale e le prestazioni fisiche 1,2, le misurazioni dell'assorbimento del glucosio muscolare durante varie condizioni hanno ricevuto molta attenzione. Nell'uomo e negli animali, il morsetto iperinsulinemico-euglicemico è stato utilizzato come tecnica gold standard per valutare la sensibilità all'insulina in vivo 3,4. In contrasto con i risultati ottenuti da un test di tolleranza al glucosio orale, la tecnica del morsetto iperinsulinemico-euglycemic non richiede una funzione gastrointestinale intatta o la secrezione di insulina dal pancreas e consente quindi di confrontare le risposte insuliniche tra soggetti che presentano variazioni nella funzione gastro-intestinale e/o pancreatica. Le misurazioni dell'assorbimento di glucosio muscolare in vivo durante l'esercizio negli esseri umani sono state eseguite frequentemente dal 19605. Prima con l'uso di tecniche di equilibrio artero-venoso6 e successivamente con l'uso della tomografia ad emissione di positroni (PET) in combinazione con un analogo del glucosio che emette positroni, ad esempio 18F-Fluoro-deossi-glucosio7. Nei roditori, l'assorbimento di glucosio muscolare stimolato dall'esercizio in vivo viene tipicamente eseguito mediante l'uso di analoghi del glucosio radioattivi o isotopici stabili 8,9,10.
Un metodo complementare alle misurazioni dell'assorbimento muscolare di glucosio in vivo consiste nell'isolare e incubare piccoli muscoli dai roditori e successivamente misurare l'assorbimento del glucosio utilizzando analoghi del glucosio radioattivi o stabili marcati con isotopi 11,12,13. Questo metodo consente una quantificazione accurata e affidabile dei tassi di assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico maturo e può essere eseguito in presenza di varie concentrazioni di insulina e durante la contrazione suscitata dalla stimolazione elettrica. Ancora più importante, le misurazioni dell'assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico isolato e incubato sono rilevanti quando si studia il fenotipo metabolico muscolare di topi che hanno subito vari interventi (ad esempio nutrizione, attività fisica, infezioni, terapie). Il modello di muscolo scheletrico isolato è anche uno strumento adatto per i test farmacologici dei composti che possono influenzare l'assorbimento del glucosio di per sé e / o modificare la sensibilità all'insulina12,14. In questo modo, l'efficacia dei composti progettati per regolare il metabolismo del glucosio muscolare può essere testata e valutata in un ambiente altamente controllato prima di successivi test in vivo in modelli animali pre-clinici.
In alcune condizioni, la vitalità metabolica può rappresentare una sfida nel sistema modello muscolare scheletrico isolato e incubato. Infatti, la mancanza di un sistema circolatorio nei muscoli incubati comporta che l'erogazione di substrati (ad esempio ossigeno e sostanze nutritive) dipenda completamente dalla semplice diffusione tra le fibre muscolari e l'ambiente circostante. A questo proposito, è importante che i muscoli incubati siano piccoli e sottili e quindi rappresentino meno di una barriera per la diffusione dell'ossigeno durante l'incubazione15. Soprattutto durante le incubazioni prolungate per diverse ore, possono svilupparsi stati ipossici a causa di un insufficiente apporto di ossigeno con conseguente esaurimento dell'energia muscolare15. Sebbene in precedenza siano stati riportati vari marcatori di vitalità metabolica nel muscolo di ratto incubato insieme all'identificazione di importanti variabili che aiutano a mantenere la vitalità muscolare del ratto15, una valutazione completa della vitalità metabolica nei piccoli muscoli di topo incubati è ancora giustificata. Quindi, allo stato attuale, il contenuto di glicogeno è stato utilizzato principalmente come marcatore di vitalità metabolica nel muscolo scheletrico del topo incubato16,17.
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per misurare l'assorbimento di glucosio basale, insulino-stimolato e contrazione nel soleo isolato e incubato e nel muscolo EDL dai topi usando il [3H]2-deossi-D-glucosio radiomarcato e [14C]mannitolo come marcatore extracellulare. Nel presente studio, l'assorbimento di glucosio è stato misurato durante un periodo di 10 minuti e il metodo è presentato con l'uso di concentrazioni di insulina submassimili e massimamente efficaci, nonché un singolo protocollo di contrazione. Tuttavia, i protocolli qui descritti possono essere facilmente modificati per quanto riguarda il tempo di incubazione, il dosaggio dell'insulina e il protocollo di stimolazione elettrica. Inoltre, forniamo una caratterizzazione approfondita di vari marcatori di vitalità metabolica nel soleo incubato e nel muscolo di topo EDL. I risultati indicano che l'integrazione di glucosio nel tampone di incubazione è essenziale per preservare la vitalità metabolica del muscolo incubato per 1 ora.

<table><tbody><tr><td>[14C]D-mannitolo</td><td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td><td>ARC 0127</td><td></td></tr><tr><td>[3H]2-deossi-D-glucosio&nbsp;</td><td>Chimica radiomarcata americana, Inc.</td><td>ART 0103A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deossi-D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>D8375</td><td></td></tr><tr><td>4-0 USP sutura chirurgica in nylon non sterile</td><td>Apparecchio di Harvard</td><td>51-7698</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina/HRP (coniugato)</td><td>DAKO</td><td>P0397</td><td>Utilizzato per rilevare la proteina ACC</td></tr><tr><td>Anticorpo Akt2</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3063</td><td></td></tr><tr><td>AMPK&alfa; 2 anticorpi</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19131</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>benzamidina</td><td>Sigma</td><td>B6505</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1020831000</td><td></td></tr><tr><td>Kit di calibrazione (forza)</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>300041</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescenza</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Merck</td><td>1084180100</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitolo</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Programma di raccolta dati</td><td>National Instruments</td><td>Software LabVIEW versione 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi</td><td>Visking</td><td>DTV.12000.09 Dimensione n.9</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging digitale</td><td>BioRad</td><td>ChemiDoc MP</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma EDS</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore elettrico di impulsi</td><td>Digitimer</td><td>D330 Sistema</td><td></td>MultiStim</tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7637</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Novo Nordisk</td><td>Actrapid, 100 IE/mL</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873025</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1058860500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema miografico a striscia</td><td>muscolare Danese Myo Technology A/S</td><td>Modello 820MS</td><td></td></tr><tr><td>Na-Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Na-pirofosfato</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Na-piruvato</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106041000</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S1504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>VWR</td><td>27778260</td><td></td></tr><tr><td>pACC Ser212 anticorpi</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3661</td><td></td></tr><tr><td>pAkt Thr308 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9275</td><td></td></tr><tr><td>pAMPK Thr172 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2531</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsulfonilfluoruro</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi in platino</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>300145</td><td></td></tr><tr><td>pTBC1D4 Ser588 anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>8730</td><td></td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione</td><td>Perkin Elmer</td><td>Tri-Carb-2910TR</td><td></td></tr><tr><td>Fluido a scintillazione&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi statistiche</td><td>Systat</td><td>SigmaPlot versione 14</td><td></td></tr><tr><td>TBC1D4 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab189890</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Merck</td><td>Milli-Q Reference A+ System</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione dell'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Il muscolo scheletrico è un tessuto insulino-responsivo e in genere assorbe la maggior parte del glucosio che entra nel sangue dopo un pasto. Inoltre, è stato riportato che il muscolo scheletrico può aumentare l'estrazione di glucosio dal sangue fino a 50 volte durante l'esercizio rispetto alle condizioni di riposo. L'aumento dell'assorbimento del glucosio muscolare durante l'esercizio fisico e la stimolazione dell'insulina dipende dalla traslocazione del trasportatore di glucosio 4 (GLUT4) dai compartimenti intracellulari alla membrana della superficie delle cellule muscolari, nonché dalla fosforilazione del glucosio in glucosio-6-fosfato da parte dell'esochinasi II. L'isolamento e l'incubazione di muscoli di topo come m. soleus e m. extensor digitorum longus (EDL) è un modello ex vivo appropriato per studiare gli effetti dell'insulina e della contrazione indotta elettricamente (un modello per l'esercizio) sull'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico maturo. Pertanto, il modello ex vivo consente la valutazione della sensibilità all'insulina muscolare e consente di abbinare la produzione di forza muscolare durante la contrazione garantendo un reclutamento uniforme delle fibre muscolari durante le misurazioni dell'assorbimento del glucosio muscolare. Inoltre, il modello descritto è adatto per i test farmacologici dei composti che possono avere un impatto sulla sensibilità all'insulina muscolare o possono essere di aiuto quando si cerca di delineare la complessità regolatoria dell'assorbimento del glucosio nel muscolo scheletrico.
Qui descriviamo e forniamo un protocollo dettagliato su come misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e dalla contrazione in preparati muscolari isolati e incubati di soleo ed EDL da topi usando radiomarcato [3H]2-deossi-D-glucosio e [14C]mannitolo come marcatore extracellulare. Ciò consente una valutazione accurata dell'assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico maturo in assenza di fattori confondenti che possono interferire nel modello animale intatto. Inoltre, forniamo informazioni sulla vitalità metabolica del muscolo scheletrico del topo incubato suggerendo che il metodo applicato possiede alcuni avvertimenti in determinate condizioni quando si studia il metabolismo energetico muscolare.

Come mostrato nella Figura 2, i tassi di assorbimento basale del glucosio erano simili tra soleo isolato e muscolo EDL di topi femmina. Questo è stato anche riportato più volte prima di 12,13,19,20. L'assorbimento di glucosio è aumentato di ~ 0,8 e ~ 0,6 volte raggiungendo 12 e 9 μmol / g di proteine / h nel soleo e nel muscolo EDL,...

La regolazione intatta dell'assorbimento del glucosio muscolare è importante per mantenere l'omeostasi del glucosio in tutto il corpo. Questo protocollo presenta la valutazione dell'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e dalla contrazione nel muscolo scheletrico maturo isolato e incubato quando delinea l'impatto di vari interventi fisiologici sul metabolismo del glucosio di tutto il corpo.

Misurazione dell'assorbimento di glucosio stimolato da insulina e contrazione in muscolo scheletrico maturo isolato e incubato da topi

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Il modello ex vivo è un metodo utile per valutare l'impatto di vari interventi fisiologici e composti farmacologici e l'assorbimento del glucosio muscolare. Questa tecnica consente la valutazione accurata dell'assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico isolato del topo in assenza di fattori confondenti che possono interferire in un modello animale intatto. Prima di iniziare un esperimento, accendere il sistema di biografia della striscia muscolare integrato e riscaldare le camere a 30 gradi Celsius.Aprire il software di raccolta dati e calibrare i trasduttori forzati per garantire la comparabilità tra i set di dati. Aggiungere quattro millilitri di mezzo di incubazione basale preriscaldato a 30 gradi Celsius a ciascuna camera di incubazione e assicurarsi che il mezzo sia continuamente ossigenato con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Posizionare il mouse in posizione prona su un vassoio di dissezione e confermare la mancanza di risposta al riflesso del pedale.Quindi appuntare una singola zampa anteriore con un ago. Utilizzare le forbici per rimuovere la pelle dalla parte inferiore della gamba fino a quando non sono visibili sia il tendine d'Achille che l'articolazione del ginocchio. Per la dissezione del muscolo soleo, attaccare un singolo anello di sutura di 0,4 centimetri di diametro preparato da un pezzo di sutura chirurgica di nylon non assorbibile di 16 centimetri al tendine di Achille e fissare la pinza di peen al tendine di Achille distalmente al cappio.Tagliare per rilasciare i muscoli soleo e gastrocnemio dalla zampa e far scorrere con attenzione la pinza del pipì attraverso il topo per esporre il muscolo soleo. Fissare la pinza di peen e posizionare un secondo anello di sutura attorno al tendine prossimale del muscolo soleo. Tagliare il tendine prossimale e sezionare il soleo, compresi i due anelli di sutura attaccati liberi dal muscolo gastrocnemio.Al momento della raccolta, utilizzare i loop per collegare rapidamente il muscolo soleo ai rispettivi ganci in una delle camere di incubazione. Utilizzare una pinza per rimuovere la fascia che copre il muscolo tibiale anteriore. I tendini distali dei muscoli tibiali anteriori o EDL dovrebbero essere chiari bianchi, visibili e separati l'uno dall'altro.Tagliare il tendine distillato del muscolo tibiale anteriore e sezionare il muscolo. Utilizzare una pinza per liberare delicatamente il muscolo EDL dai tessuti circostanti, lasciando il muscolo intatto senza tagliare i tendini. Posizionare i singoli anelli di sutura attorno al distillato e ai tendini EDL prossimali.Quando i loop sono stati posizionati, tagliare i tendini per rilasciare il muscolo EDL con le anse di sutura attaccate e collegare rapidamente le anse ai ganci nella seconda camera di incubazione. Quindi regolare la tensione di riposo di ciascun muscolo a circa cinque millinewton e consentire ai muscoli di equilibrarsi nel mezzo per almeno 10 minuti prima di iniziare l'esperimento. Per misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina, sostituire il mezzo di incubazione basale nelle camere con il mezzo di incubazione senza insulina, una concentrazione di insulina efficace summisionalmente o una concentrazione di insulina massimamente efficace per un'incubazione di 20 minuti.Alla fine del periodo di stimolazione, sostituire il mezzo di incubazione con un mezzo di incubazione per l'assorbimento del glucosio contenente una concentrazione identica di insulina per un'incubazione di 10 minuti. Alla fine dell'incubazione dell'assorbimento del glucosio, rimuovere con cura i muscoli dalle camere di incubazione e lavare i campioni in un mezzo di incubazione basale ghiacciato. Dopo il lavaggio, asciugare rapidamente i muscoli su carta da filtro e congelare il tessuto senza i loop di sutura in azoto liquido.Quindi raccogliere 100 microlitri del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera per lo stoccaggio di 20 gradi Celsius e l'analisi dell'assorbimento del glucosio muscolare. Per misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dalla contrazione, posizionare gli elettrodi di platino centralmente e su entrambi i lati dei muscoli all'interno delle camere di incubazione e avviare la contrazione muscolare immediatamente dopo aver sostituito il mezzo di incubazione basale con il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio. Registrare la produzione forzata da ciascun muscolo incubato.Dopo 10 minuti, raccogliere e congelare delicatamente i muscoli come dimostrato, immagazzinando 100 aliquote di microlitro del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera per l'analisi dell'assorbimento del glucosio muscolare come dimostrato. Per determinare la segnalazione miocellulare mediante analisi western blotting nello stesso set di campioni muscolari, omogeneizzare ogni campione muscolare congelato in 400 microlitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciato e ruotare il campione end over end per un'ora a quattro gradi Celsius. Quindi raccogliere il licato per centrifugalizzazione e misurare la quantità di proteine di interesse all'interno di ciascun pallet campione secondo i protocolli di analisi western blot standard.Per misurare l'assorbimento di glucosio in ciascun campione, aggiungere 150 microlitri di surnatante da ciascun campione e 25 microlitri di mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio dalle camere di incubazione corrispondenti per separare i flaconcini di conteggio a scintillazione liquida contenenti tre millilitri di liquido di scintillazione liquida per flaconcino. Quindi caricare i flaconcini su un contatore di scintillazione liquida e misurare la radioattività di due deossiglucosio e mannitolo secondo le linee guida del produttore. In questa analisi rappresentativa, i tassi di assorbimento basale del glucosio erano simili tra i muscoli soleo ed EDL isolati dai topi femmina.L'assorbimento di glucosio è aumentato nei muscoli soleo ed EDL in risposta a concentrazioni di insulina sia submassimali che massimamente efficaci. Inoltre, sia l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina submassimale che quello massimale erano significativamente più alti nel muscolo soleo. Al contrario, l'assorbimento di glucosio indotto dalla contrazione era significativamente più alto nell'EDL rispetto al muscolo soleo.Qui, si può osservare la forza muscolare massima prodotta nei muscoli soleo ed EDL durante il periodo di stimolazione di 10 minuti. Come previsto, il muscolo EDL ha generato più forza durante la parte iniziale del periodo di stimolazione, seguita da un rapido declino più tardi nel periodo di stimolazione. Le concentrazioni submassimali e massime di insulina hanno indotto un aumento della fosforilazione di Akt treonina 308 e TBC1D4 serina 588, mentre la contrazione ha indotto un aumento della fosforilazione di AMPK Alfa treonina 172 e ACC serina 212.Né l'insulina né la contrazione hanno portato a un cambiamento nel contenuto proteico totale. Prima di tentare di misurare l'assorbimento del glucosio nei muscoli isolati del topo, è fondamentale praticare a fondo la dissezione dei muscoli soleo ed EDL. Dopo la valutazione dell'assorbimento del glucosio muscolare, il lisato proteico muscolare rimanente può essere utilizzato per ulteriori analisi biochimiche che possono chiarire i cambiamenti osservati nei tassi di assorbimento del glucosio.

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