Name: Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Impara la microscopia a due fotoni in vivo per visualizzare ripetutamente la dinamica cellulare nel cervello di topi CX3CR1 GFP. Questa tecnica consente studi longitudinali sulle interazioni neuro-gliali e sui cambiamenti morfologici.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Eyo per aver discusso le idee presentate in questo manoscritto. Ringraziamo il Dr. Justin Rustenhoven del Kipnis Lab dell'Università della Virginia per il dono di topi NG2DsRed 33. Questo lavoro è supportato da finanziamenti del National Institute of Neurological Disorders and Stroke del National Institute of Health a U.B.E (K22 NS104392).

Tutte le fasi sono conformi alle linee guida stabilite e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Virginia.
1. Preparazione del mouse per l'impianto della finestra cranica
NOTA: Varie linee di topo transgeniche con etichette florescenti sono adatte per l'imaging.
<ol><li>Utilizzare i topi CX3CR1GFP/o 26 per visualizzare la microglia in vivo. Tipicamente, vengono utilizzati topi da giovani a giovani adulti di 4 a 10 settimane che pesano 17-25 g. NOTA: Anche se, questo approccio è anche adatto per i topi pre-svezzati, la necessità di restituire i topi alla loro gabbia con le loro madri per l'alimentazione, può complicare il recupero se la madre non si prende cura adeguata dei cuccioli post-chirurgia. Pertanto, si raccomanda l'uso di topi post-svasamento.</li>
	<li>Anestetizzare il topo utilizzando isoflurane (5% di flusso in ossigeno per l'induzione per 1 min) in una camera anestetica. Verifica che il mouse non mostri alcunmovimento o risposte contrazioni ai pizzichi dei dito e/o della coda. Togliere il mouse fuori dalla camera e all'aria aperta accuratamente radere i capelli sulla testa tra le orecchie da circa il livello degli occhi alla parte superiore della regione del collo utilizzando un trimmer per capelli. NOTA: la concentrazione dell'isoflurane utilizzato dipende dalle dimensioni della camera di induzione. Pertanto, per le camere più piccole, 3-4% isoflurane può essere utilizzato per indurre efficacemente l'anestesia, mentre le camere più grandi richiederanno fino al 5%.</li>
	<li>Spostare il mouse sul cono naso della stazione di chirurgia stereotassica per l'anestesia (1,5-2% per la manutenzione per l'intervento chirurgico), stabilizzare la testa utilizzando le barre dell'orecchio e mantenere il mouse su un pad di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea calda.</li>
	<li>Lubrificare entrambi gli occhi con unguento degli occhi. Iniettare 100 l di 0,25% di bupivicaina (per fornire analgesia locale al topo che durerà 8-12 h) e 100 L di 4 mg/mL dexamethasone (per ridurre l'infiammazione che può derivare dalla procedura chirurgica) subsously nel sito di incisione. Lasciare che il mouse si sieda per almeno 5 min prima di passare alla fase successiva.</li>
	<li>Pulire la testa rasata con tre tamponi alternati di betadine e 70% di alcol. Fare un'incisione del cuoio capelluto midline utilizzando lama chirurgica o forbici che si estendono dalla parte posteriore della regione del cranio tra le orecchie alla zona frontale tra gli occhi. La pelle rimanente viene tagliata per esporre il cranio.</li>
	<li>Pulire il tessuto connettivo situato tra il cuoio capelluto e il cranio sottostante con 3% di perossido di idrogeno (H2O2) e localizzare l'area del cervello per essere mappata con coordinate stereotassiche. NOTA: C'è spesso qualche sanguinamento (passaggio 1.5) dall'incisione sulla superficie del cranio. Questo sanguinamento di solito si risolve da solo entro 3-5 min. La pulizia con il perossido aiuta. Si noti anche un precedente trattamento bupivacaina (passaggio 1.4) per limitare la quantità di sanguinamento durante questo periodo.</li>
</ol>2. Chirurgia dell'impianto della finestra cranica del topo
<ol><li>Forare un'apertura circolare di 4 mm nel cranio utilizzando una punta di trapano dentale (diametro della punta di 0,7 mm) e rimuovere con attenzione questa porzione del cranio con pinze appuntite. Per l'imaging della corteccia somatosensoriale di topi di 6-8 settimane, individuare il centro della craniotomia a -2,5 posteriore e 2,0 laterale al bregma. Durante la perforazione, inumidire regolarmente il cranio con sterili tamponi salini e tamponi di cotone per raffreddare il cervello, pulire i detriti ossei e ammorbidire l'osso del cranio per la rimozione finale. NOTA: Le coordinate per la craniotomia variano a seconda della regione di interesse e dell'età dei topi.</li>
	<li>Dopo aver rimosso il cranio, posizionare con cura una piccola copertura (dimensioni #0 di spessore di 0,1 x 0,02 mm) inumidita con salina nella craniotomia. Asciugare la salina in eccesso con una salvietta sterile.</li>
	<li>Utilizzando un applicatore appuntito (come una punta di pipetta o l'estremità appuntita di un bastoncino di cotone in legno rotto), applicare la colla cianoacrylate intorno alla finestra e consentirgli di attaccarsi al cervello e al cranio. Applicare la colla primer sul resto del cranio e curarla con una luce di polimerità per 20-40 s. Preparare un pozzo intorno alla finestra con la colla finale e curare con una luce di polimerità per 20-40 s.</li>
	<li>Incollare una piccola piastra di testa sul cranio sull'emisfero contralaterale della craniotomia prima con la colla primer come primer e poi con la colla finale. Curare entrambi con la luce di polimerità per 20-40 s ciascuno. NOTA: Le suture non sono necessarie se il cranio è totalmente coperto con la colla durante questa procedura.</li>
</ol>3. Assistenza post-chirurgica
<ol><li>Lasciare che il mouse si svegli in assenza di anestesia (recupero fatto su un pad di riscaldamento riduce il tempo di recupero) e restituirlo alla sua gabbia di casa una volta completamente sveglio. Iniettare una dose sottocutanea di buprenorfina SR (0,5 mg/kg) come analgesia post-operatoria sufficiente per 72 h.</li>
	<li>Per facilitare un recupero sano dall'intervento chirurgico, fornire al topo un alimento più morbido, che può essere sotto forma di chow solido regolare in acqua per ammorbidire il chow o il cibo sotto forma di un gel. NOTA: Una fornitura una tantera del cibo morbido subito dopo l'intervento chirurgico è sufficiente.</li>
	<li>Monitorare il mouse ogni giorno per la salute e il recupero corretto per le prime 72 h della procedura chirurgica. Successivamente, eseguire l'imaging da 2 settimane dalla chirurgia dell'impianto della finestra. NOTA: Se fatto bene, i topi recuperano bene mostrando i normali comportamenti ambulatoriali, sufficiente esplorazione della gabbia, buona idratazione, aumento di peso stabile e ampie interazioni con altri topi nella gabbia e altri elementi nella gabbia. Topi che mostrano letargia, disidratazione e maggiore del 10% perdita di peso dopo l'intervento chirurgico sono eutanasia e rimossi dallo studio.</li>
</ol>4. Mappatura del cervello a due fotoni per l'imaging iniziale
<ol><li>Anestesizzare il topo (Isoflurane, 5 % induzione e 1,5 % di manutenzione). Stabilizzare la testa con viti per montare la testata sullo stadio del microscopio a due fotoni, essendo mantenuta su una piastra di riscaldamento a 35 gradi centigradi. Iniettare per via intraperitonelmente 100 l di tintura del vaso sanguigno come Rhodamine B (2 mg/mL). NOTA: L'imaging potrebbe essere fatto anche in topi svegli senza anestesia. Tuttavia, studi recenti indicano che l'anestesia colpisce le dinamiche di sorveglianza microgliale27,28,29 e che la fissazione della testa per due fotoni nei topi svegli aumenta lo stress anche durante l'imaging cronico per almeno 25 giorni (vedi Juczewski et al., 2020)30.</li>
	<li>Pulire delicatamente la superficie della finestra cranica utilizzando un tampone di cotone tamponato nel 70% di etanolo. Mettere qualche goccia di acqua o salina sulla finestra cranica e abbassare l'obiettivo nella soluzione poiché l'obiettivo è una lente ad immersione.</li>
	<li>Disegnare a mano una mappa grossolana per indicare i principali punti di riferimento dei vasi sanguigni in un taccuino di laboratorio mentre si guarda attraverso l'oculare per epiflorescenza. Utilizzare questo disegno per identificare le regioni specifiche durante l'imaging di due fotoni. In alternativa, scattare foto dei vasi sanguigni attraverso una fotocamera montata al microscopio o attraverso una fotocamera portatile o un telefono. NOTA: Queste immagini e immagini disegnate a mano devono facilitare la rivisitazione delle stesse regioni al microscopio prima di due immagini di fotoni. Non si tratta di una mappatura precisa delle immagini.</li>
	<li>Nell'ambito di due fotoni, raccogliere le immagini di cellule florescenti e vasi in base alle esigenze. Prendere appunti attenti con le coordinate appropriate per garantire che le regioni precise possano essere rivisitate per le immagini successive. Raccogliere diversi campi visivi in questa sessione di imaging iniziale, ad esempio acquisire immagini z-stack ogni 1-2 m attraverso un volume di tessuto. NOTA: Durante la raccolta di immagini da due fotoni, i punti di riferimento dei vasi sanguigni vengono utilizzati per la mappatura grossolana. Se è necessaria una mappatura fine, vengono utilizzati dendriti con etichetta YFP da topi Thy1-YFP31.<ol>
<li>Utilizzare questi parametri consigliati per l'imaging: una lunghezza d'onda di 880-900 nm è ottimale; per l'eccitazione GFP e/o dsRed/ Rhodamine, vengono utilizzati uno specchio dicroico di 565 nm con 525/50 nm (canale verde) e 620/60 nm (canale rosso) filtri di emissione; per la separazione GFP e YFP, vengono utilizzati uno specchio dicromatico di 509 nm con filtri di emissione 500/15 e 537/26 nm; la potenza al cervello è mantenuta a 25 mW o al di sotto; risoluzione dell'immagine è 1024 x 1024 pixel, il campo visivo preso con un obiettivo 25X 0.9 NA a un fattore di zoom 1.5X è 295,24 x 295,24 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alla fine dell'imaging, togliere il mouse dal palco, lasciarlo svegliare dall'anestesia e tornare alla sua gabbia di casa fino a una futura sessione di imaging.</li>
</ol>5. Imaging e ri-imaging a due fotoni
<ol><li>Per le future sessioni di imaging successive, che potrebbero essere da poche ore a mesi dopo la sessione di imaging iniziale, anthetizzare il topo (Isoflurane, 5% induzione e 1,5% di manutenzione), montare sul microscopio a due fotoni, mantenere su una piastra di riscaldamento e iniettare 100 z l un colorante del vaso sanguigno come Rhodamine B (2 mg/mL).</li>
	<li>Aprire le immagini ottenute in precedenza in ImageJ e, utilizzando queste immagini e le note della sessione precedente, identificare le aree precedentemente imaged e rivederle con attenzione.</li>
	<li>Ripetere questa operazione per tutto il tempo in cui la finestra di imaging è chiara o essenziale per l'estensione dello studio.</li>
</ol>

<ol><li>Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Translational+Disease+Modeling+Using+Human+iPSC-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons.</a> Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Microfluidic+Models+for+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).</li>
<li>Croushore, C. A., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+studying+neurotransmitters+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission.</a> Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).</li>
<li>Wu, V. W., Schwartz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+for+reactive+gliosis%3A+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives.</a> J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tool+to+test+long-term+effects+of+chemicals+on+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Brain+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic Brain Slice Cultures.</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59(2018).</li>
<li>Heine, C., Franke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+co-culture+systems+to+study+axon+regeneration+in+the+dopaminergic+system+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).</li>
<li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecualar+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45(2019).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Kerr, J. N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo%3A+watching+the+brain+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Akassoglou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+CNS+Injury+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease.</a> Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).</li>
<li>Tran, C. H., Gordon, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+and+microvascular+imaging+in+awake+animals+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy.</a> Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).</li>
<li>Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Microglial+Calcium+Signaling+in+Brain+Inflammation+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366(2017).</li>
<li>Bennett, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Ontogeny+and+CNS+Environment+Establishes+Microglial+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity.</a> Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunology.</a> Science. 353 (6301), 760-761 (2016).</li>
<li>Kipnis, J., Filiano, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmunology+in+2017%3A+The+central+nervous+system%3A+privileged+by+immune+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).</li>
<li>Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome%3A+stress%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">The microbiome: stress, health and disease.</a> Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).</li>
<li>Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome-The+Missing+Link+in+the+Gut-Brain+Axis%3A+Focus+on+Its+Role+in+Gastrointestinal+and+Mental+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521(2018).</li>
<li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+two-photon+imaging+of+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Liu, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+network+activity+controls+microglial+process+surveillance+in+awake+mice+via+norepinephrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).</li>
<li>Stowell, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+signaling+in+the+wakeful+state+inhibits+microglial+surveillance+and+synaptic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Two-Photon+Imaging+of+Anesthesia-Specific+Alterations+in+Microglial+Surveillance+and+Photodamage-Directed+Motility+in+Mouse+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12R-Dependent+Translocation+Mechanisms+Gate+the+Changing+Microglial+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape.</a> Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+progenitors+balance+growth+with+self-repulsion+to+achieve+homeostasis+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).</li>
<li>Berthiaume, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Remodeling+of+Pericytes+In+Vivo+Maintains+Capillary+Coverage+in+the+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+persistent+dendritic+spines+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo.</a> Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).</li>
<li>Wang, C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PLoS One. 8 (6), 67680(2013).</li>
<li>Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+genetic+access+to+transiently+active+neurons+via+TRAP%3A+targeted+recombination+in+active+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations.</a> Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neurogenesis+in+the+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus.</a> Science. 359 (6376), 658-662 (2018).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+fluorescence+microscopy+imaging+of+neural+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo.</a> Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).</li>
<li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of neural activity.</a> Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+deep+neural+activity+from+the+cortical+surface+during+hippocampal+epileptiform+events+in+the+rat+brain+using+electrical+impedance+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography.</a> Neuroimage. 209, 116525(2020).</li>
<li>Kulkarni, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Voltage+Imaging+with+Sulfonated+Rhodamine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'avvento dell'imaging a due fotoni in vivo ha aperto l'opportunità di esplorare la pletora di interazioni cellulari e dinamiche che si verificano nel cervello sano. Initial studies focused on using the open skull craniotomy approach to image neuronal dendrites by both acute and chronic imaging37,38. Questo può essere utilizzato anche per chiarire le interazioni neuroimmuni nel cervello. Questo protocollo descrive un metodo per l'imaging affidabile delle cellule ...

Il sistema nervoso centrale (CNS) è governato da una complessa interazione di interazioni tra vari tipi di cellule residenti, tra cui neuroni, glia e cellule associate ai vasi. Tradizionalmente, le cellule neurali sono state studiate in contesti isolati, co-coltura1,2,3,4,5 (in vitro) o ascisi (ex vivo)6,7,8,9,10. Tuttavia, c'è bisogno di comprendere ulteriormente il comportamento delle cellule neurali e le interazioni nell'ambiente nativo del cervello intatto in vivo. In questo protocollo, descriviamo un metodo per mappare le regioni in vivo di interesse e ri-immaginare con precisione quelle regioni in future sessioni di imaging per tenere traccia delle complesse interazioni tra i vari tipi di cellule CNS per lunghi periodi di tempo.
Lo sviluppo di approcci di imaging in vivo ha fornito significativi vantaggi per la corretta comprensione della funzione neurale11,12,13,14,15. In particolare, questi approcci offrono diversi vantaggi rispetto agli approcci tradizionali in vitro ed ex vivo. In primo luogo, i sistemi di imaging in vivo hanno componenti cellulari e tissutali fisiologicamente rilevanti come la vascolatura con il repertorio completo delle interazioni cellulari per fornire una comprensione completa della fisiologia della rete neurale. In secondo luogo, recenti scoperte suggeriscono che quando vengono rimosse dal loro ambiente nativo, alcune cellule neurali (come la microglia) perdono caratteristiche importanti della loro identità e quindi della fisiologia16,17 che possono essere conservate nell'ambiente in vivo. In terzo luogo, i sistemi di imaging in vivo offrono l'opportunità di indagini longitudinali stabili da settimane a mesi per studiare le interazioni cellulari del SNC. Infine, date le crescenti prove dei contributi del sistema immunitario periferico18,19 e del microbioma20,21 nella fisiologia del CNS, i sistemi in vivo forniscono una piattaforma per interrogare tali contributi ed effetti sulle cellule del SNC. Pertanto, gli approcci che utilizzano l'imaging in vivo longitudinale per studiare la fisiologia neuro-immune e le interazioni in stati sani, feriti e malati sono una grande aggiunta complementare agli approcci tradizionali.
In questo protocollo, descriviamo un approccio affidabile all'immagine di diversi tipi di cellule nel cervello, tra cui microglia, neuroni e cellule NG2- come esempi. Sono stati sviluppati due approcci per visualizzare le cellule neurali in vivo: l'approccio del cranio assottigliato e il cranio aperto con un approccio cranico alla finestra. Anche se gli approcci al cranio assottigliati sono in uso e sono preferiti perché superano alcuni degli svantaggi dell'approccio al cranio aperto come l'attivazione delle cellule gliali, la dinamica della colonna vertebrale superiore a quella fisiologica e l'uso di agenti antinfiammatori22,23,24,25, approcci cranio assottigliati mostrano anche alcuni inconvenienti critici. In primo luogo, la procedura di assottigliamento è una procedura molto delicata che molti ricercatori trovano difficile da perfezionare soprattutto quando è necessario re-diradning. Questo è il caso perché è spesso difficile per gli sperimentatori accertare di aver assottigliato il cranio a una profondità di 20 m. In secondo luogo, per un confronto adeguato tra i topi, l'assottigliamento dovrebbe essere identico e una varietà di successo di assottigliamento tra sessioni di imaging o topi potrebbe complicare la visualizzazione delle strutture neurali. In terzo luogo, se impiegati per l'imaging longitudinale, gli animali con teschi assottigliati possono essere utilizzati solo per un numero limitato di sessioni quando viene impiegato il re-sottile del cranio. Forth, poiché parte del tessuto osseo rimane ancora, la chiarezza di imaging potrebbe essere compromessa dall'approccio del cranio assottigliato, consentendo una grande visualizzazione di regioni più superficiali ma non tanto con le regioni più profonde. Alla luce di questo, strutture cerebrali più profonde come l'ippocampo, non possono essere imagete con successo con l'approccio del cranio assottigliato. Queste considerazioni sollevano la necessità di approcci alternativi e complementari che potrebbero superare tali preoccupazioni.
Alternativa all'approccio del cranio assottigliato, l'approccio all'impianto della finestra del cranio aperto utilizza una procedura in cui il cranio viene sostituito con un coperchio di vetro otticamente chiaro. Ciò consente un numero quasi illimitato di sessioni di imaging. Inoltre, data la sostituzione del cranio con la vetrina di vetro, questo metodo consente una chiara finestra di visualizzazione delle cellule cerebrali marcate fluorescenti per lunghi periodi da ore a mesi e, quindi, può essere impiegato per studiare l'attività cellulare e le interazioni che sono rilevanti per la fisiologia, l'invecchiamento e la patologia.
Nel complesso, dettagliamo i passi che possono essere seguiti per fare finestre craniche croniche implantare attraverso una craniotomia stereotassica che consente l'imaging in vivo delle regioni cerebrali di interesse. Descriviamo anche come la vascolatura cerebrale grossolanamente stabile o i dendriti fluorescenti potrebbero essere utilizzati per generare una mappa grossolana o fine, rispettivamente delle regioni cerebrali di interesse. Questo approccio può quindi essere utilizzato per l'imaging ripetuto in più sessioni. L'importanza di questa tecnica, quindi, sta nella sua capacità di immaginare i cambiamenti a lungo termine o la stasi negli elementi cerebrali, tra cui la disposizione, la morfologia e le interazioni dei diversi tipi cellulari.

<table><tbody><tr><td>Coverglass (3mm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0726</td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica (colla Krazy)</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2</td><td></td></tr><tr><td>Demi Ultra LED Curing Light System</td><td>Dental Health Products, Inc</td><td>910860-1</td><td></td></tr><tr><td>Trapano dentale</td><td>Osada: www.osadausa.edu</td><td>EXL-M40</td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>#19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi</td><td>Henry Schien</td><td>1338333</td><td></td></tr><tr><td>iBond Total Etch (colla primer)</td><td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td><td>66040094</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Millipore Sigma</td><td>81-88-9 (R6626)</td><td></td></tr><tr><td>Tetris Colla Evoflow (Colla finale)</td><td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td><td>#595956</td><td></td></tr><tr><td>Wahl Brav Mini+</td><td>Amazon</td><td></td><td></td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1</tr></tbody></table>

mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

Il sistema nervoso centrale (CNS) è regolato da un complesso gioco di cellule neuronali, gliali, stromali e vascolari che facilitano la sua corretta funzione. Anche se studiare queste cellule in isolamento in vitro o insieme ex vivo fornisce informazioni fisiologiche utili; caratteristiche salienti della fisiologia delle cellule neurali mancheranno in tali contesti. Pertanto, c'è la necessità di studiare le cellule neurali nel loro ambiente nativo in vivo. Il protocollo qui descritto descrive l'imaging ripetitivo in vivo a due fotoni delle cellule neurali nella corteccia del roditore come strumento per visualizzare e studiare celle specifiche per lunghi periodi di tempo da ore a mesi. Descriviamo in dettaglio l'uso della vascolatura cerebrale grossolanamente stabile come una mappa grossolana o dendrites fluorescente come una mappa fine di alcune regioni cerebrali di interesse. Usando queste mappe come chiave visiva, mostriamo come le cellule neurali possono essere riposizionate con precisione per la successiva imaging in vivo ripetitivo. Utilizzando esempi di immagini in vivo di microglia fluorescente, neuroni ecellule NG2, questo protocollo dimostra la capacità di questa tecnica di consentire la visualizzazione ripetitiva delle dinamiche cellulari nella stessa posizione del cervello per lunghi periodi di tempo, che possono aiutare ulteriormente a comprendere le risposte strutturali e funzionali di queste cellule nella fisiologia normale o a seguire insulti patologici. Ove necessario, questo approccio può essere accoppiato all'imaging funzionale delle cellule neurali, ad esempio con l'imaging del calcio. Questo approccio è particolarmente una tecnica potente per visualizzare l'interazione fisica tra diversi tipi di cellule del CNS in vivo quando sono disponibili modelli di topo genetici o coloranti specifici con tag fluorescenti distinti per etichettare le cellule di interesse.

Per visualizzare le dinamiche microgliali in vivo, sono stati utilizzati doppi topi transgenici CX3CR1GFP/-a:Thy1YFP. La linea Thy1-YFP H viene utilizzata in contrapposizione alla linea Thy1-GFP M per evitare la sovrapposizione di florescenza di microglia (GFP) e neuroni (YFP). Gli approcci alternativi potrebbero utilizzare una linea reporter in cui la microglia è etichettata con ad esempio tdTomato e quindi la linea Thy1-GFP M. Uno svantaggio della linea H è che YFP etichetta un sacco di neuroni e ...

Questo protocollo descrive una tecnica cronica di impianto della finestra cranica che può essere utilizzata per l'imaging longitudinale di strutture neuro-glio-vascolari, interazioni e funzione sia in condizioni sane che malate. Serve come alternativa complementare all'approccio di imaging transcranico che, sebbene spesso preferito, possiede alcune limitazioni critiche.

Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Questo protocollo dimostra come la microscopia In Vivo Two-Photon possa essere utilizzata per eseguire la visualizzazione ripetitiva della dinamica cellulare, nella stessa posizione cerebrale per lunghi periodi di tempo. Il vantaggio di questa tecnica è che, permette di immaginere i cambiamenti a lungo termine negli elementi cellulari del cervello, compresa la disposizione, la morfologia e le interazioni fisiche tra il diverso tipo di cellula del SNC. Questa tecnica può essere particolarmente utile per suscitare interazioni cellula-cellula, dinamica cellulare e cambiamenti morfologici durante la plasticità cerebrale e la neurodegenerazione.Inizia preparando un giovane o giovane adulto, dai quattro ai 10 settimane, un topo eterozigote CX3CR1 GFP, che pesa da 17 a 25 grammi, per un impianto cranicio della finestra. Dopo aver anestetizzato il topo, usa un trimmer per capelli per radere i capelli sulla testa, tra le orecchie, approssimativamente, dal livello degli occhi, alla parte superiore della regione del collo. Spostare il mouse nella stazione di chirurgia stereotassia, cono del naso e stabilizzare la testa usando le barre dell'orecchio.Mantenere il mouse sulla pastiglia di riscaldamento, durante tutta la procedura. Lubrificare entrambi gli occhi con unguento ad olio, quindi iniettare 100 microlitri dello 0,25% di bupivacaina e 100 microlitri di quattro milligrammi per millilitro desametasone, per via sottocutanea nel sito di incisione. Attendere almeno cinque minuti prima di procedere.Sanguinare la testa rasata, con tre tamponi alternati di betadina e il 70% di alcol. Quindi fare un'incisione del cuoio capelluto della linea mediana con una lama chirurgica o forbici. Si estende dalla parte posteriore della regione del cranio, tra le orecchie, all'area frontale tra gli occhi.Tagliare la pelle rimanente per esporre il cranio. Sanguinare il tessuto connettivo situato tra il cuoio capelluto e il cranio sottostante con il 3% di perossido di idrogeno e localizzare l'area cerebrale da visualizzare con coordinate stereotattiche. Forare un'apertura circolare, circa quattro millimetri nel cranio, usando una punta di perforazione dentale.Durante la perforazione, inumidire regolarmente il cranio con tamponi soluzione salini e di cotone sterili per raffreddare il cervello. Sgombro via i detriti ossei e ammorbidisci l'osso del cranio. Al termine, rimuovere con cura questa porzione del cranio con forcep appuntite.Dopo che il cranio è stato rimosso, posizionare con cura un piccolo vetro di copertura, inumidito con soluzione salina nella craniotomia. Asciugare la salina in eccesso usando una salvietta sterile. Usando un applicatore appuntito, applicare la colla cianoacrilato intorno alla finestra e consentirgli di attaccarsi al cervello e al cranio.Applicare la colla primer sul resto del cranio e polimerirla con una luce di polimerizzazione per 20-40 secondi. Creare un pozzo intorno alla finestra con la colla finale e curarlo con una luce di polimerizzazione per 20-40 secondi. Incollare una piccola piastra della testa sul cranio, sull'emisfero contralto, la craniotomia, con la colla del primer, e quindi con la colla finale, polimerindo entrambi per 20-40 secondi.Dopo che il topo si è svegliato, iniettare una dose sottocutanea di buprenorfina SR come analgesia postoperatoria, che sarà sufficiente per 72 ore. Ravvivare il topo con cibo salato extra per facilitare un sano recupero. L'imaging può essere eseguito già due settimane dopo l'intervento chirurgico di impianto.Utilizzare viti per montare la piastra della testa sullo stadio del microscopio a due fotoni, che dovrebbe essere mantenuto a 35 gradi Celsius con una piastra riscaldante. Iniettare il topo per via sottocutanea con 100 microlitri di colorante per vasi sanguigni, come rhodamine B.Pulire delicatamente la superficie della finestra craniciale con un batuffolo di cotone, tamponato al 70% di etanolo. Metti alcune gocce d'acqua o soluzione salina sulla finestra e abbassa l'obiettivo nella soluzione.Assicurati che il laser sia spento mentre l'obiettivo si sta abbassando e disegna una mappa del corso per indicare i principali punti di riferimento dei vasi sanguigni, mentre guardi attraverso l'oculare. Utilizzare questo disegno per identificare le aree specifiche durante l'imaging a due fotoni. Raccogli immagini di celle fluorescenti e vasi utilizzando l'imaging a due fotoni.Vedi il manoscritto testuale per i parametri di imaging, prendi appunti attenti con le coordinate appropriate, per assicurarti che le regioni precise possano essere rivisitate per un'immagine successiva. Disegna come diversi campi visivo in questa sessione di imaging iniziale, Alla fine dell'imaging, togli il mouse dal palco, permettigli di svegliarsi dall'anestesia e restituirlo alla sua gabbia di casa. Utilizzare le note e le immagini ottenute per ri-imaging delle aree durante le sessioni successive.Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare Microglial Dynamics In Vivo, a Taiwan YFP-H line mice. Dendriti specifici, servivano come punti di riferimento stabili per la mappatura fine delle regioni cerebrali. Mentre i dendriti sono stabili, alcune microglia si muovono ogni giorno.Singoli topi transgenici CX3CR1/GFP, sono stati utilizzati per seguire microglia per un massimo di otto settimane. Le iniezioni di rodiammina B sono state utilizzate per etichettare la vascuola, durante ogni sessione di imaging. Mentre la vascucolatura rimane stabilmente fissa, le microglia sono dinamiche.I topi CX3CR1/GFP, sono stati utilizzati per seguire le microglia prima e dopo gravi convulsioni. La struttura del letto vascolare è stata mantenuta, ma la rete cellulare microgliale e il paesaggio di posizione erano transitori. Cambiamenti maggiori sono stati osservati entro 24-48 ore da convulsioni.I doppi topi transgenici CX3CR1/GFP e NG2DS-Red sono stati utilizzati per tracciare le microglia e NG2 per le cellule positive in Vivo. Senza etichettare la vascucolatura, sono state identificate microglia e parassiti associati ai vasi e cellule precursori degli oligodendrociti, o OPC. I parassiti hanno processi allungati che seguono lungo la parete vascolare, e gli OPC mostrano tipicamente corpi cellulari più grandi che risiedono nel parenchima cerebrale, lontano dalla vascolarizzazione.Quando è stata utilizzata la rodiammina B, la fluorescenza più luminosa dei parassiti poteva essere distinta dalla fluorescenza più debole della rodiammina luminare, nonostante un'eccitazione simile durante l'imaging. L'imaging quotidiano ha mostrato che i parassiti erano posizionati stabilmente, mentre gli OPC e le microglia erano dinamici. È importante fare un'attenta osservazione dell'area da visualizzare, disegnare una mappa rappresentativa il più accurata possibile e indicare i passi compiuti per raggiungere le altre località rispetto al punto di partenza.Nelle sessioni di imaging successive, questi passaggi, le mappe disegnate a mano e le immagini scattate in precedenza saranno fondamentali per identificare ripetutamente le stesse posizioni. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di chiarire interazioni neuronali-gliali, interazioni neuro-immunitarie e dinamiche neuro-cellulari di lunghi periodi di tempo sia in salute che in patologia.

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L'imaging con tomografia seriale a due fotoni (STPT) è una tecnica per visualizzare una massa di tessuto nella sua forma tridimensionale combinando l'imaging a due fotoni con il controllo automatico dello stadio e lo slicing del microtomo. Qui descriviamo un protocollo per implementarlo per i cervelli degli uistitì per comprendere meglio le loro caratteristiche strutturali.

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