Sfruttare la turbidità e la tromboelastografia per la caratterizzazione complementare dei coaguli

I test di tromboelastografia e torbidità sono due metodi semplici e distintivi per la caratterizzazione del coagulo. Queste tecniche insieme offrono una comprensione più completa di come le variabili di coagulazione influenzano le funzionalità del coagulo. Entrambi questi test, non solo offrono analisi del coagulo di endpoint, ma attirano anche la formazione di coaguli di fibrina nel tempo, a differenza di molti altri strumenti di caratterizzazione del coagulo Queste tecniche possono aiutare a sviluppare una piattaforma di coaguli sintetici fisiologicamente rilevante in grado di fornire una diagnosi affidabile dello stato fibrinolitico dei pazienti con trombosi Per monitorare la torbidità del coagulo nel tempo, utilizzare qualsiasi spettrometro disponibile in commercio che abbia un intervallo di assorbanza da 350 a 700 nanometri.

Accendere lo spettrometro e aprire il software di analisi corrispondente. Quindi selezionare la piastra uno e aprire la scheda impostazioni piastra. Fare clic su ABS e cinetico per monitorare un'assorbanza dinamica nel tempo.

Selezionare 550 nanometri nella scheda lunghezza d'onda, quindi passare alla scheda di temporizzazione e regolare il runtime totale a 60 minuti con un intervallo di 30 secondi, selezionare i pozzi di interesse evidenziandoli. Pipetta 140 microlitri di PBS in un unico pozzo di una piastra di pozzo UV trasparente 96. Quindi aggiungere 10 microlitri di trombina e mescolare, avviare immediatamente la coagulazione aggiungendo 50 microlitri di fibrinogeno al pozzo e pipettare su e giù cinque volte utilizzando solo la prima fermata della pipetta facendo attenzione ad evitare di creare bolle.

Posizionare la piastra nel supporto della piastra e fare clic su leggi nel software per avviare la lettura della torbidità. Al termine della lettura, recuperare i dati sulla torbidità e ottenere una curva di tracciamento della torbidità tracciando la variazione degli assorbenti nel tempo, derivare la massima torbidità prendendo il valore massimo di assorbanza della curva nel tempo, quindi calcolare la torbidità massima del 90% moltiplicando la torbidità massima per 0,9. Derivare il tempo alla massima torbidità calcolando il tempo dall'inizio del coagulo alla torbidità massima del 90%.

Accendere l'analizzatore tromboelastografico o TEG e attendere che la temperatura si stabilizzi a 37 gradi Celsius, quindi aprire il software TEG e creare un nome di esperimento nella sezione ID. Fare clic sulla scheda TEG e seguire le istruzioni visualizzate per eseguire un test eTest per tutti i canali. Quindi riposizionare la leva nella posizione di carico una volta completati tutti i controlli.

Fare clic su Fatto nella pagina delle informazioni e immettere le informazioni di esempio per i canali che verranno utilizzati. Posizionare una tazza TEG trasparente non patinato nel canale corrispondente. Far scorrere il supporto verso l'alto e premere la tazza in basso cinque volte per fissare il perno all'asta di torsione, quindi abbassare il supporto e premere la tazza verso il basso nella base fino a quando non fa clic.

Pipettare 20 microlitri di soluzione di trombina nella tazza TEG, quindi avviare la coagulazione aggiungendo 340 microlitri di fibrinogeno nella tazza per ottenere una soluzione di coagulazione a 360 microlitri. Mescolare il contenuto della tazza pipettando su e giù cinque volte. Far scorrere il portante caricato a tazza verso l'alto spostare la leva nella posizione di lettura e fare clic su Avvia nel software per avviare la lettura TEG.

Una volta completata la lettura recuperate i parametri e ottenete una curva di traccia TEG tracciando l'ampiezza nel tempo. Eleggere MA come massima ampiezza, il che è indicativo della tensione del coagulo e del TMA come tempo per la massima ampiezza dal software. Qui sono mostrate torbidità rappresentativa e curve di tracciamento TEG di coaguli di fibrina umana e bovina a diversi livelli di fibrinogeno.

Le curve di tracciamento dimostrano che dopo un periodo di ritardo successivo all'iniziazione del coagulo, la torbidità del coagulo o l'ampiezza del coagulo aumenta nel tempo e si stacca alla fine della formazione del coagulo. La torbidità massima e il tempo alla massima torbidità sono i due parametri derivati dalla torbidità, mentre la massima ampiezza e il tempo alla massima ampiezza derivano dal TEG. Ad un livello più elevato di fibrinogeno nella soluzione di coagulazione tutti e quattro i valori aumentano.

La massima torbidità è una misura ottica della struttura del coagulo, che è indicativa dello spessore della fibra di fibrina e della densità della rete di fibrina. Mentre la massima ampiezza è una misura meccanica che riflette la tensione assoluta del coagulo, nel complesso i due valori forniscono una visione gratuita delle micro strutture del coagulo. Questa procedura illustra un modello di coagulazione semplificato per esaminare le variabili che influiscono principalmente sulla polimerizzazione della fibrina.

Questo modello può essere personalizzato attraverso l'inclusione di ulteriori fattori di coagulazione per studiare altri parametri. Il modello di coagulazione può essere facilmente modificato utilizzando campioni clinici di plasma per monitorare la formazione di coaguli e la disillusione in presenza di farmaci antitrombotici. I risultati potrebbero guidare la gestione terapeutica nei pazienti.