Name: Un nuovo paradigma pavloviano di condizionamento della paura per studiare il congelamento e il comportamento di volo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Scopri un paradigma di condizionamento pavloviano per studiare i comportamenti difensivi nei roditori, analizzando le transizioni tra congelamento e volo. Questo metodo offre approfondimenti sul PTSD e i disturbi d'ansia.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Louisiana Board of Regents attraverso il Fondo di sostegno del Board of Regents (LEQSF(2018-21)-RD-A-17) e il National Institute of Mental Health dei National Institutes of Health con il numero di premio R01MH122561. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

Le seguenti fasi/procedure sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali dopo l'approvazione da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Tulane.
1. Preparazione dei topi
<ol><li>Utilizzare topi adulti maschi e/o femmine di età compresa tra 3 e 5 mesi. Nel presente studio, abbiamo utilizzato topi maschi C57BL/6J ottenuti dal Jackson Laboratory, ma è possibile utilizzare qualsiasi ceppo di topo di un fornitore affidabile.</li>
	<li>Almeno una settimana prima dell'esperimento, ospitare tutti i topi singolarmente su un ciclo chiaro/scuro di 12:12 ore durante lo studio. Fornire ai topi l'accesso ad libitum al cibo e all'acqua.</li>
	<li>Eseguire tutti gli esperimenti comportamentali durante il ciclo della luce. Eseguire tutte le sessioni contemporaneamente all'ora del giorno all'interno di una singola coorte. Ad esempio, se si avvia l'esperimento alle 9 del mattino del giorno 1, continuare a partire da quel momento fino al completamento dell'esperimento.</li>
</ol>2. Preparazione di materiali di studio
<ol><li>Contesti di studio<ol>
<li>Scegli due contesti diversi in cui eseguire gli esperimenti.</li>
		<li>Utilizzare una camera cilindrica composta da plexiglas chiare (diametro 30 cm) come contesto A, con un pavimento in plexiglas liscio. L'altezza della camera dovrebbe essere sufficiente per evitare la fuga (alta almeno 30 cm).</li>
		<li>Per il contesto B utilizzare un involucro rettangolare (25 cm x 30 cm) con un pavimento a griglia elettrica utilizzato per fornire footshock a corrente alternata. L'altezza di questa camera è molto importante e dovrebbe essere alta almeno 35 cm. In alternativa, utilizzare un tetto trasparente (assicurarsi che il video possa essere registrato attraverso questo materiale). NOTA: utilizzare una camera con superfici pareti lisce che possono essere facilmente pulite.</li>
		<li>Utilizzare una soluzione di pulizia diversa per pulire i contesti. Ad esempio, contesto pulito A con 1% acido acetico e contesto B con 70% di etanolo. Pulire i contesti prima di iniziare la prima sessione, tra il test dei singoli mouse e dopo il completamento delle sessioni della giornata. Questo è vitale per rimuovere i segnali olfattivi dai topi precedenti. Una pulizia accurata aiuterà anche a prevenire il ridimensionamento delle urine sulla griglia d'urto, il che comprometterà le sessioni di condizionamento. NOTA: Le soluzioni di pulizia fungono anche da spunto olfattivo, quindi utilizzano lo stesso liquido detergente per un particolare contesto.</li>
		<li>Posizionare il contesto A o il contesto B in una casella attenuante del suono durante le rispettive sessioni di studio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generatore audio<ol>
<li>Montare un altoparlante sopra i contesti per fornire stimoli uditivi a 75 dB.</li>
		<li>Utilizzare un generatore audio programmabile per generare stimoli uditivi in base a una pianificazione predefiniti. Il tono puro a 7,5 kHz è un suono con una forma d'onda sinusoidale, mentre il rumore bianco è un segnale casuale con uguale intensità a frequenze diverse, che vanno da 1-20.000 Hz.</li>
		<li>Utilizzare impulsi TTL per fornire stimoli uditivi e segnali d'urto con precisione temporale. NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, misurare l'uscita dell'intensità sonora dall'altoparlante montato in ogni camera utilizzando un misuratore dB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ammortizzatore: collegare l'ammortizzatore con il pavimento della rete elettrica che viene utilizzato per esegnire lo shock CA da 0,9 mA. Definire la frequenza, l'inizio e la durata degli shock in un programma per computer. Fornire ogni stimolo d'urto alla fine di ogni SCS per una durata di 1 s, per un totale di cinque accoppiamenti SCS-shock per sessione di condizionamento.</li>
</ol>3. Preparazione di programmi per computer e tracciamento video
<ol><li>Generare protocolli comportamentali utilizzando la codifica in un programma software.</li>
	<li>Nel programma, definire lo stimolo composto seriale SCS. Questo stimolo è una presentazione seriale di un tono puro di 10 s (ogni pip è presentato per 500 ms, alla frequenza di 7,5 kHz e velocità di 1 Hz) e 10 s di rumore bianco (500 ms pips a 1 Hz).</li>
	<li>Definire gli intervalli inter-trial (ITI) presentati dopo ogni prova, pseudocasualmente.</li>
	<li>Durante lo studio, registrare tutto il comportamento del mouse in video per l'analisi successiva. NOTA: le scatole di condizionamento della paura disponibili in commercio potrebbero non essere configurate per registrare i comportamenti attraverso la fotocamera montata in alto. Questo è molto importante poiché il video registrato viene utilizzato per calcolare il movimento orizzontale, la velocità e la distanza totale percorsa dall'animale.</li>
	<li>Per impostare il tracciamento software, posizionare un mouse di prova in ogni contesto pertinente, regolare la sensibilità di tracciamento del contorno e definire il centro di gravità. Ciò garantirà l'acquisizione di dati affidabili sulla posizione relativa. Inoltre, definire l'intera area di contesto accessibile al soggetto. NOTA: La regolazione della dimensione del contorno per entrambi i contesti è importante in quanto il cambiamento di luminosità in contesti diversi cambierà la dimensione del contorno.</li>
	<li>Determinare un coefficiente di calibrazione utilizzando le dimensioni note delle camere e le dimensioni dei pixel della fotocamera che possono essere utilizzate per calcolare la velocità (cm/s).</li>
	<li>Sincronizzare gli eventi timestamp del computer di acquisizione dati con le occorrenze in tempo reale.</li>
</ol>4. Esperimento comportamentale
<ol><li>Accendi tutte le apparecchiature: computer, controller della scatola di condizionamento della paura, shocker e software di registrazione video e timestamp. Assicurarsi che gli strumenti siano accesi nell'ordine appropriato.</li>
	<li>Controlla tutte le funzioni, tra cui tono, rumore bianco e consegna degli urti, e configura il sistema per l'acquisizione dei dati.</li>
	<li>Trasporta gli animali dal loro ripostiglio al locale di condizionamento. Consentire loro di acclimatarsi lì per almeno 10 minuti.</li>
	<li>Portare l'animale fuori dalla gabbia di casa, posizionarlo delicatamente nel rispettivo contesto e quindi attivare immediatamente i programmi per computer. NOTA: L'inizializzazione del sistema di condizionamento della paura e del software di raccolta dati (timestamp, tracciamento del mouse e registrazione video) alla volta può essere sincronizzata utilizzando attivazioni mediate da impulsi TTL.</li>
	<li>Precondizione/Pre-esposizione<ol>
<li>Il primo giorno, inserire il soggetto nel contesto A (contesto neutro). Lasciare che si acclimati alla camera per 3 minuti (il periodo di riferimento), quindi esporla a 4 prove di un SCS della durata totale di 20 s(Figura 1A-1B).</li>
		<li>Mantenere uno pseudocasuale medio di 90 s ITI (intervallo 80-100 s). La durata totale di ogni sessione di pre-esposizione è di 590 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condizionamento della paura<ol>
<li>Il giorno 2 e il giorno 3, inserire il soggetto nel contesto B. Dopo un periodo di riferimento di 3 minuti, esporre il soggetto a cinque accoppiamenti della co-terminazione SCS con un footshock CA da 1 s, 0,9 mA.</li>
		<li>Mantenere uno pseudocasuale medio di 120 s ITI (intervallo 90-150 s). Fare in modo che ogni sessione di condizionamento abbia una durata totale di 820 s (Figura 1A).</li>
		<li>A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, sottoseni i topi il giorno 4 a un test di richiamo (vedi fase 4.7) o a temere l'estinzione (vedi fase 4.8).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richiamo della paura (per testare la dipendenza dal contesto)<ol>
<li>Il giorno 4, inserire il soggetto nel contesto A. Dopo il periodo di riferimento di 3 minuti, presentarlo con 4 prove della SCS senza piede, oltre 590 s.</li>
		<li>Mantenere uno pseudocasuale medio di 90 s ITI (intervallo 80-100 s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estinzione della paura<ol>
<li>Il giorno 4, inserire il soggetto nel contesto B. Dopo il periodo di riferimento di 3 minuti, presentare 16 prove della SCS senza piede, oltre gli anni '1910.</li>
		<li>Mantenere uno pseudocasuale medio di 90 s ITI (intervallo 60-120 s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Riportare l'animale nella sua gabbia di casa e ripetere la procedura per tutti gli animali.</li>
</ol>5. Quantificazione del comportamento
<ol><li>Fare in modo che un osservatore cieco all'esperimento segni i video registrati per il comportamento di congelamento utilizzando la soglia automatica del rilevatore di congelamento seguita da un'analisi fotogramma per fotogramma delle modifiche ai pixel. NOTA: altri pacchetti software possono anche essere utilizzati per calcolare automaticamente il congelamento utilizzando il sistema a 2 telecamere. È anche possibile per un osservatore segnare manualmente il comportamento di congelamento.</li>
	<li>Definire il congelamento come una cessazione completa dei movimenti corporei, ad eccezione di quelli necessari per la respirazione, per un minimo di 1 s.</li>
	<li>Il punteggio salta quando tutte e 4 le zampe lasciano il pavimento, con conseguente movimento verticale e/o orizzontale.</li>
	<li>Esportare il file contrassegnato con marcatori di blocco, salto ed eventi.</li>
	<li>Estrarre eventi rilevanti (congelamento e salti) da periodi di tempo definiti (ad esempio, durata di 10 s di rumore pre-SCS, tono e bianco, per ogni prova).</li>
	<li>Utilizzando le durate di inizio-arresto estratte degli eventi in un file di foglio di calcolo, calcolare la durata del blocco (in s) sottraendo l'ora di inizio dall'ora di fine, dai rispettivi periodi di prova.</li>
	<li>Rappresenta questi dati per quanto riguarda la prova o il giorno, sommando la durata di congelamento di tutte le prove. NOTA: A seconda dello scopo dello studio, i comportamenti di volo o congelamento possono essere segnati e calcolati da qualsiasi prova / durata dalla sessione di studio.</li>
	<li>Sommare il numero totale di salti da una particolare durata di prova.</li>
	<li>Estrarre il file generato dalle coordinate di tracciamento del mouse dal fotogramma per fotogramma il movimento dell'asse X-Y del centro di gravità del mouse e calcolare la velocità del mouse (cm/s). NOTA: I dati sulla velocità possono essere presenti nel formato cm/s o pixel/s. Convertire l'unità pixel/s in cm/s utilizzando il valore inch o cm/pixel definito nel video per tale contesto di test (vedere la sezione 3.6).</li>
	<li>Dopo aver estratto i dati sulla velocità per il movimento fotogramma per fotogramma dell'animale, in base alla frequenza fotogrammi del video (preferibilmente 30 fotogrammi /s), calcolare la velocità media dell'animale in una specifica staffa del numero di fotogramma (moltiplicare i tempi di inizio e fine in s per 30 per ottenere il numero di fotogramma iniziale e finale).</li>
	<li>Calcola i punteggi di volo dividendo la velocità media durante ogni SCS per la velocità media durante i 10 s pre-SCS (linea di base, BL) e quindi aggiungendo 1 punto per ogni salto di fuga (speedCS / speedBL + # di salti). Un punteggio di volo di 1 indica quindi nessun cambiamento nel comportamento di volo rispetto al periodo pre-SCS.</li>
	<li>Facoltativamente, segna i video manualmente per altri comportamenti come l'allevamento e la toelettatura.</li>
</ol>6. Analisi statistica
<ol><li>Analizzare i dati per la significatività statistica utilizzando il software di analisi statistica. Per tutti i test, la definizione di significatività statistica è P<0.05.</li>
	<li>Controllare i dati per la distribuzione normale utilizzando il test di normalità Shapiro-Wilk (α=0,05).</li>
	<li>Per testare l'effetto dei segnali, effettuare i confronti a coppie utilizzando l'appropriato test parametrico (test t accoppiato) o non parametrico (test di classificazione firmato Wilcoxon).</li>
	<li>Per valutare l'interazione a 2 modi dei fattori (prova cue X), eseguire un ANOVA a 2 modi seguito da test post-hoc (ad esempio, il test di confronto multiplo di Bonferroni / test di Tukey).</li>
</ol>

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<li>Borkar, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+behavioral+responses+during+a+conditioned+flight+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Sex differences in behavioral responses during a conditioned flight paradigm.</a> Behavioural Brain Research. 389, 112623(2020).</li>
<li>Fadok, J. P., Markovic, M., Tovote, P., Lüthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+on+central+amygdala+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New perspectives on central amygdala function.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 141-147 (2018).</li>
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<li>Canteras, N. S., Graeff, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+and+modulatory+neural+circuits+of+defensive+reactions%3A+Implications+for+panic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Executive and modulatory neural circuits of defensive reactions: Implications for panic disorder.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. , (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I parametri di suono e shock descritti sono elementi importanti di questo protocollo. È quindi fondamentale testare l'ampiezza degli urti e il livello di pressione sonora prima di iniziare gli esperimenti. Gli studi sul condizionamento della paura utilizzano in genere 70-80 dB di livelli di pressione sonora e 0,1-1 mA di intensitàd'urto 18; pertanto, i parametri descritti sono entro i limiti dei paradigmi tradizionali di condizionamento della paura. In un precedente esperimento di controllo solo C...

La paura è una risposta adattiva evolutivamente conservata a una minacciaimmediata 1,2. Mentre gli organismi possiedono risposte difensive innate a una minaccia, le associazioni apprese sono cruciali per ottenere risposte difensive appropriate agli stimoli predittivi del pericolo3. La disregolazione nei circuiti cerebrali che controllano le risposte difensive può contribuire a reazioni disadattative associate a molteplici disturbi d'ansia debilitanti, come il disturbo da stress post-traumatico (PTSD), il disturbo di panico4e fobiespecifiche 5,6. Il tasso di prevalenza negli Stati Uniti per i disturbi d'ansia è del 19,1% per gli adulti e del 31,9% negli adolescenti7,8. Il peso di queste malattie è estremamente elevato sulla routine quotidiana degli individui e influisce negativamente sulla loro qualità di vita.
Negli ultimi decenni, il condizionamento della paura pavloviano è servito come un potente sistema modello per ottenere una visione straordinaria dei meccanismi neurali alla base dell'apprendimentoe della memoria legati alla paura 9,10,11. Il condizionamento della paura pavloviano comporta l'abbinamento di uno stimolo condizionato (CS, come uno stimolo uditivo) con uno stimolo avverso non condizionato (US; ad esempio, un footshock elettrico)12. Poiché il congelamento è il comportamento dominante evocato e misurato nei paradigmi di condizionamento pavloviano standard, i meccanismi di controllo neurale delle forme attive di comportamento difensivo come le risposte di fuga / volo rimangono in gran parte inesplorate. Studi precedenti mostrano che diverse forme di comportamento difensivo, come il volo, vengono evocate a seconda dell'intensità della minaccia,della vicinanza e del contesto 13,14. Studiare come il cervello controlla diversi tipi di comportamento difensivo può contribuire in modo significativo alla comprensione dei processi neuronali che sono disregolati nei disturbi della paura e dell'ansia.
Per rispondere a questa esigenza critica, abbiamo sviluppato un paradigma di condizionamento pavloviano modificato che suscita salti di volo e fuga, oltre al congelamento15. In questo paradigma, i topi sono condizionati con uno stimolo composto seriale (SCS) costituito da un tono puro seguito da rumore bianco. Dopo due giorni di accoppiamento della SCS con un forte calzata elettrica, i topi mostrano congelamento in risposta al componente tono e al volo durante il rumore bianco. Gli interruttori comportamentali tra il congelamento condizionato e il comportamento di volo sono rapidi e coerenti. È interessante notare che i topi mostrano un comportamento di volo solo quando il rumore bianco CS è presentato nello stesso contesto di un footshock precedentemente consegnato (il contesto condizionante) ma non in un contesto neutro. Invece, le risposte di congelamento dominano in questo contesto neutro, con livelli significativamente maggiori di congelamento in risposta al rumore bianco rispetto al tono. Ciò è coerente con il ruolo del contesto nella modulazione dell'intensità della risposta difensiva e con il ruolo regolatore dell'informazione contestuale nell'apprendimento e nella memoria legati alla paura che si trovano nei paradigmitradizionali di condizionamento delle minacce 16,17. Questo modello consente confronti diretti all'interno del soggetto di più comportamenti difensivi in un modo specifico del contesto.

<table><tbody><tr><td>Contesto</td><td></td><td></td> neutro <td>Cilindro in plexiglass 30 X 30 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Scatola di condizionamento della paura</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>VFC-008</td><td>25 X 30 X 35 cm dimensioni</td></tr><tr><td>Generatore audio&nbsp;</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>ANL-926&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Shocker</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV-414S</td><td>Altoparlante a griglia in acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Med</td><td>Associates, Inc.</td><td>ENV-224AM</td><td>Adatto per toni puri e rumore bianco&nbsp;</td></tr><tr><td>C57/BL6J topi Jackson</td><td>laboratorio, USA</td><td>664</td><td>Invecchiato 3-5 mesi</td></tr><tr><td>Software Cineplex (Editor/ studio)</td><td>Plexon</td><td>CinePlex Studio v3.8.0</td><td>Per il monitoraggio video e l'analisi del punteggio comportamentale</td></tr><tr><td>Software MedPC V</td><td>Med Associates, Inc.</td><td>SOF-736</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Plexon</td><td></td><td>Utilizzato per estrarre i dati di congelamento segnati in PlexonEditor</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>Versione 8</td><td>Software di analisi statistica</td></tr></tbody></table>

un nuovo paradigma pavloviano di condizionamento della paura per studiare il congelamento e il comportamento di volo

A Novel Pavlovian Fear Conditioning Paradigm to Study Freezing and Flight Behavior

I comportamenti legati alla paura e all'ansia contribuiscono in modo significativo alla sopravvivenza di un organismo. Tuttavia, le risposte difensive esagerate alla minaccia percepita sono caratteristiche di vari disturbi d'ansia, che sono la forma più diffusa di malattia mentale negli Stati Uniti. Scoprire i meccanismi neurobiologici responsabili dei comportamenti difensivi aivimenterà lo sviluppo di nuovi interventi terapeutici. Il condizionamento della paura pavloviano è un paradigma di laboratorio ampiamente usato per studiare l'apprendimento e la memoria legati alla paura. Una delle principali limitazioni dei paradigmi tradizionali di condizionamento della paura pavloviano è che il congelamento è l'unico comportamento difensivo monitorato. Recentemente abbiamo sviluppato un paradigma pavloviano modificato per il condizionamento della paura che ci consente di studiare sia il congelamento condizionato che il comportamento di volo (noto anche come fuga) all'interno dei singoli soggetti. Questo modello utilizza calzini a maggiore intensità e un maggior numero di accoppiamenti tra lo stimolo condizionato e lo stimolo incondizionato. Inoltre, questo paradigma di volo condizionato utilizza la presentazione seriale di toni puri e stimoli uditivi del rumore bianco come stimolo condizionato. Seguendo il condizionamento in questo paradigma, i topi mostrano un comportamento di congelamento in risposta allo stimolo del tono e risposte di volo durante il rumore bianco. Questo modello di condizionamento può essere applicato allo studio di transizioni rapide e flessibili tra le risposte comportamentali necessarie per la sopravvivenza.

Come descritto nel diagramma (Figura 1A), la sessione inizia con la pre-esposizione (Giorno 1), seguita dal condizionamento della paura (Giorni 2 e 3), e poi l'estinzione o il recupero (Giorno 4).
Le presentazioni dell'SCS nella sessione di pre-esposizione (giorno 1) non hanno suscitato la risposta al volo o al congelamento nei topi(figura 2A-2B). L'analisi comportamentale durante il condizionamento (Giorni 2 e 3) ha ...

Le risposte comportamentali difensive dipendono dall'intensità della minaccia, dalla vicinanza e dal contesto di esposizione. Sulla base di questi fattori, abbiamo sviluppato un paradigma di condizionamento classico che suscita chiare transizioni tra congelamento condizionato e comportamento di volo all'interno dei singoli soggetti. Questo modello è fondamentale per comprendere le patologie coinvolte in ansia, panico e disturbi da stress post-traumatico.

Un nuovo paradigma pavloviano di condizionamento della paura per studiare il congelamento e il comportamento di volo

Fear- and anxiety-related behaviors significantly contribute to an organism&#8217;s survival. However, exaggerated defensive responses to perceived threat ...

L'obiettivo generale di questo paradigma è valutare un comportamento difensivo complesso nei roditori. Questo protocollo è significativo perché facilita le indagini sulle transizioni tra comportamenti difensivi, rendendolo ideale per i ricercatori interessati a studiare complesse risposte adattive alla minaccia. Questo protocollo utilizza stimoli di condizione temporaneamente precisi per ottenere la transizione tra le risposte difensive, permettendoci di studiare entrambi, il congelamento condizionato e i comportamenti di volo all'interno del singolo soggetto.L'uso di questo modello per scoprire i meccanismi del comportamento difensivo può fornire informazioni sulla disfunzione legata alla PTSD e sui disturbi del panico e potrebbe aiutare nello sviluppo di nuove terapie. Per impostare i protocolli comportamentali, nel programma, definire la SCS, impostando gli stimoli da fornire come un tono puro di dieci secondi, o un rumore bianco di dieci secondi, e definendo gli intervalli inter-trial da presentare pseudo-casualmente dopo ogni prova. Per impostare il rilevamento software, posizionare un mouse di prova in ogni contesto pertinente, definire il centro di gravità e regolare le dimensioni del contorno.Utilizzare le dimensioni delle camere e le dimensioni in pixel della fotocamera per determinare il coefficiente di calibrazione. Quindi, generare il codice di impulso TTL per sincronizzare gli indicatori di evento del computer centrale con le loro occorrenze in tempo reale. Prima di iniziare un esperimento, accendi il controller della scatola di condizionamento della paura, lo shocker e il software di registrazione video.Montare un altoparlante sopra i contesti per la consegna degli stimoli uditivi a 75 decibel e impostare un generatore audio programmabile per generare stimoli uditivi su una pianificazione predefinita. Dopo aver confermato che il rumore tono e bianco sono funzionali, impostare il sistema per l'acquisizione dei dati e trasportare topi maschi o femmine di tre o cinque mesi nella sala di condizionamento. Prima di iniziare la prova di precondizione, pulire una camera in plexiglass cilindrico trasparente alta 30 centimetri con acido acetico dell'1% da utilizzare come camera di contesto A.Per la precondizione, posizionare il mouse nel contesto A e consentirgli di acclimatarsi per tre minuti prima di esporre il mouse a quattro percorsi SCS di 20 secondi con un intervallo inter-trial pseudo-casuale medio di 90 secondi. Dopo 10 minuti di acclimatazione, trasferire un mouse nella camera di contesto A e attivare immediatamente il sistema di condizionamento della paura e i programmi di raccolta dei dati. Prima di iniziare un esperimento di condizionamento della paura, pulire un involucro rettangolare alto almeno 35 centimetri, 25 per 30 centimetri con un pavimento a griglia elettrica con 70%etanolo da utilizzare come camera di contesto B.Quindi, collegare l'ammortizzatore con il pavimento della griglia elettrica della camera Di contesto B e definire la frequenza, l'insorgenza e la durata degli urti nel programma per computer appropriato. Una volta impostati tutti i parametri, verificare che l'intensità dell'urto sia erogata correttamente sia dall'ammortizzatore che dal pavimento della griglia. Nei giorni due e tre, posizionare il mouse nella camera di contesto B per tre minuti prima di esporre l'animale a cinque accoppiamenti della co-terminazione SCS con uno shock del piede AC di un secondo, 0,9 milliamp e un intervallo medio inter-trial di 120 secondi.Alla fine della sessione, rimettere il mouse nella gabbia di casa. A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, sottoscrivere gli animali a una sessione di richiamo, il quarto giorno, posizionare il mouse nella camera di contesto A per tre minuti prima di presentare all'animale quattro prove SCS senza shock del piede con un intervallo inter-trial pseudo-casuale medio di 90 secondi per 590 secondi per testare la risposta fear recall dell'animale. Oppure, per testare Fear Extinction, il quarto giorno, posiziona il mouse nella camera Context B per tre minuti prima di sottoscrivere l'animale a 16 prove di SCS senza shock del piede con un intervallo inter-trial pseudo-casuale medio di 90 secondi per un periodo di 1.910 secondi.Per quantificare il comportamento del mouse, alla fine dell'esperimento, fare in modo che un osservatore cieco all'analisi segni i video registrati per il comportamento di congelamento utilizzando la soglia automatica del rilevatore di congelamento seguita da un'analisi fotogramma per fotogramma delle modifiche dei pixel. Definire il congelamento come una cessazione completa dei movimenti corporei, ad eccezione di quelli necessari per la respirazione per un minimo di un secondo. Segna un salto come istanza quando tutte e quattro le zampe lasciano il pavimento, con conseguente movimento verticale e/o orizzontale.Quando l'intero segmento è stato analizzato, esportare il file contrassegnato con marcatori di blocco, salto ed evento ed estrarre gli eventi pertinenti dai periodi di tempo definiti di interesse in un foglio di calcolo. Per calcolare la durata del congelamento, sottrarre l'ora di inizio dall'ora di fine per ogni rispettivo periodo di prova. Sommare il numero totale di salti da una particolare durata di prova.Per calcolare la velocità del mouse, tracciate le coordinate dal movimento dell'asse XY fotogramma per fotogramma del centro di gravità del mouse. Per calcolare i punteggi di volo, dividere la velocità media durante ogni SCS per la velocità media durante il pre-SCS di dieci secondi e aggiungere un punto per ogni salto di fuga. Un punteggio di volo di uno indica nessun cambiamento nel comportamento di volo dal periodo pre-SCS.Quindi, analizzare i dati per la significatività statistica utilizzando un programma software di analisi statistica appropriato. Le presentazioni SCS nella sessione di pre-esposizione non suscitano risposte di volo o congelamento nei topi. L'analisi comportamentale durante il condizionamento rivela che il componente Tone della SCS migliora significativamente il congelamento rispetto al congelamento durante il pre-SCS.I punteggi dei voli sono cambiati in modo significativo durante le sessioni e i topi mostrano velocità più elevate e più salti al segnale rumore bianco rispetto al segnale tono. I topi mostrano una chiara transizione del comportamento difensivo, che mostra punteggi di volo più bassi durante il Tone e punteggi di volo più alti durante il Rumore Bianco, con l'opposto osservato per le risposte di congelamento. I topi sottoposti a 16 prove di addestramento all'estinzione dimostrano una rapida estinzione del volo condizionato, con punteggi di combattimento durante il primo blocco di quattro prove che misurano più in alto durante il rumore bianco rispetto al segnale tono.Alla fine della sessione di estinzione, il comportamento di volo non è più suscitato da nessuno dei due segnali. Il congelamento al tono è significativamente più alto del congelamento al Rumore Bianco per il primo blocco di quattro prove durante l'estinzione. Il congelamento indotto dal tono diminuisce nei 16 studi di estinzione, mentre si osserva un aumento del congelamento mediato dal rumore bianco.Nella sessione di richiamo, l'esposizione al rumore bianco in un contesto neutro non suscita il volo, poiché i punteggi dei voli sono inferiori a uno. Piuttosto, le presentazioni white noise nel contesto neutro suscitano risposte di congelamento superiori a quelle suscitate dal tono. È importante pulire il contesto in tutto il tempo ed è fondamentale testare l'ampiezza degli urti e il livello di pressione sonora prima di iniziare un esperimento.Questo paradigma è attualmente utilizzato da gruppi che sono interessati a comprendere le complessità del comportamento difensivo e possono essere utilizzati per promuovere la nostra comprensione della selezione dell'azione difensiva.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Paura condizionata può essere ridotta attraverso un processo inibitorio chiamato estinzione, ma può riemergere in condizioni quali il passaggio del tempo o esposizione a stress. Nostro protocollo presenta un nuovo modo di prevenire recupero paura introducendo estinzione durante la finestra riconsolidazione (il ricollocamento fase di riattivazione a memoria).

Formazione estinzione durante la finestra di riconsolidamento impedisce il recupero della paura

Fonte: Childs, J. E., et al. La stimolazione del nervo vago come strumento per indurre plasticità in percorsi rilevanti per l'apprendimento dell'estinzione. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra il metodo di stimolazione del nervo vago (VNS) in un modello di ratto per ridurre il comportamento di congelamento. I ratti condizionati dalla paura ricevono VNS durante la riesposizione al suono, portando a una riduzione del congelamento e rivelando il suo potenziale terapeutico.

Stimolazione del nervo vago in un modello di ratto per ridurre il comportamento di congelamento

Questo articolo presenta un protocollo di prova paura condizionata contestuale e cued utilizzando un sistema di video analisi per valutare paura apprendimento e memoria nei topi.

Contestuali e Cued paura condizionata test utilizzando un sistema di video Analizzare in topi

Nel seguente esperimento si descrive un protocollo per la traccia di paura condizionata nei topi. Questo tipo di memoria associativa comprende un periodo di traccia che separa lo stimolo neutro e lo stimolo incondizionato.

Trace paura condizionata in topi

Questo protocollo descrive un metodo di accensione chimica con pentylenetetrazole e fornisce un modello murino di epilessia. Questo protocollo è utilizzabile anche per indagare vulnerabilità per induzione di sequestro e patogenesi dopo crisi epilettiche nei topi.

Modello di topo indotta da pentylenetetrazole accensione

Qui descriviamo la metodologia dettagliata richiesta per condurre esperimenti di apprendimento (SEFL) paura lo stress-aumentata, un modello preclinico di disturbo da stress post-traumatico, in topi e ratti. Il modello utilizza aspetti della paura pavloviano condizionata e congelamento come indice di maggiore paura nei roditori.

Paura lo stress-Enhanced Learning, un robusto modello del roditore del disturbo da Stress post-traumatico

Descriviamo un protocollo esteso di condizionamento della paura che produce sovrallenamento e incubazione della paura nei ratti. Questo protocollo prevede una singola sessione di allenamento con 25 accoppiamenti tono-shock (cioè sovrallenamento) e un confronto delle risposte di congelamento condizionate durante i test di contesto e cue 48 h (a breve termine) e 6 settimane (a lungo termine) dopo l'allenamento.

L'incubazione della paura utilizzando un protocollo esteso di condizionamento della paura per i ratti

Per studiare i comportamenti di volo in un contesto di paura, introduciamo un protocollo di condizionamento della paura modificato. Questo protocollo assicura che i topi mostrino costantemente comportamenti di volo durante la presentazione del segnale nel condizionamento della paura.

Condizionamento della paura modificato per indurre comportamenti di volo nei topi

Il paradigma della paura osservativa valuta il congelamento vicario nei roditori come modello di empatia affettiva. Questa procedura comporta l'esposizione di roditori osservatori a dimostratori conspecifici che ricevono scosse avversive del piede per suscitare risposte empatiche di congelamento. Utilizzando saggi osservativi della paura, i ricercatori possono studiare i meccanismi neurali alla base dell'empatia affettiva.

La paura osservativa come modello di empatia affettiva nei topi

Una procedura per studiare la capacità di un contesto ambientale di alcol associato per attivare il rinnovamento dei comportamenti alcol-seeking nei ratti è descritto.

Una Procedura di osservare Context-indotta Rinnovo pavloviano condizionata alcol-seeking comportamento in Rats

Scopri un paradigma di condizionamento pavloviano per studiare i comportamenti difensivi nei roditori, analizzando le transizioni tra congelamento e volo. Questo metodo offre approfondimenti sul PTSD e i disturbi d'ansia.

Un nuovo paradigma pavloviano di condizionamento della paura per studiare il congelamento e il comportamento di volo

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