Misurazione di anticorpi che inducono la fagonenza acquisita naturalmente ai parassiti Plasmodium falciparum mediante un'analisi basata sulla citometria del flusso

Questo protocollo consente di misurare la capacità degli anticorpi di opsonizzare e indurre la fagocitosi degli eriociti infetti da plasmodium falciparum. Gli anticorpi presenti nel siero di individui naturalmente esposti all'infezione parassitaria, così come quelli indotti dall'immunizzazione con antigeni parassiti, possono essere testati. A dimostrare la procedura con me sarà Maiken Visti, un tecnico del mio laboratorio.

Per impostare una coltura cellulare THP-1 per un test di fagocitosi, il giorno prima dell'esperimento semina le cellule in un pallone da coltura quadrato di 25 centimetri e una concentrazione di 2,5 per 10 alla quinta cella per millilitro in THP un mezzo di coltura cellulare. Il giorno dell'esperimento, almeno un'ora prima del blocco dell'esperimento a piastre a fondo rotondo da 96 pozzi con 150 microlitri di 2%FBS sterile in PBS per pozzo. Per il raccolto e la purificazione di eritrociti infetti da trophozoiti a metà-tardo, preparare circa 1,2 millilitri di coltura di parassiti P falciparum imballati in 10 millilitri di terreno di coltura parassitaria, con almeno il 5% di parasitemia e aggiungere a una colonna magnetica.

Lavare la colonna con 50 millilitri di mezzo di coltura parassita. Per elutare gli eriociti infetti, rimuovere la colonna dal magnete e sciacquarla con 50 millilitri di mezzo di coltura parassitaria. Quindi, raccogliere gli eriociti infetti per centrifugazione e rimorsi il pellet in un millilitro di mezzo di coltura parassitaria fresco per il conteggio.

Regolare la sospensione di eriociti infetti purificati di 3,3 per 10 alla settima cellula per millilitro nel mezzo di coltura dei parassiti contenente bromuro di etidio, a una concentrazione finale di 2,5 microgrammi per millilitro. Quindi, rimuovere la soluzione di blocco da una piastra da 96 pozzetta facendo scorrere la piastra in un contenitore di rifiuti. Quindi rimuovere l'eccesso su un tovagliolo di carta e aggiungere 30 microlitri dell'etichetta del bromuro di etidio sospensione di erytrocite infetta a tutti tranne un pozzo nella metà superiore della piastra.

Aggiungere 30 microlitri di mezzo di coltura parassitare al pozzo vuoto e incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 170 microlitri di mezzo di coltura parassitaria ad ogni pozzo e sedimentare gli eriociti infetti nella parte inferiore della piastra per centrifugazione. Rimuovere il supernatante facendo scorrere il piatto in un contenitore di rifiuti e lavare gli eriociti infetti etichettati con bromuro di etidio altre due volte, con 200 microlitri di mezzo di coltura parassitaria per bene, come appena dimostrato.

Dopo il secondo lavaggio, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere con cura l'intero volume di supernatante da ogni pozzo, senza disturbare il pellet. E ha rimosorsi gli eriociti infetti etichettati con bromuro di etidio in 30 microlitri di soluzione anticorpale, compresi i controlli appropriati e i campioni di prova precedentemente preparati nel terreno di coltura dei parassiti. Quindi, posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 45 minuti, protetta dalla luce.

Mentre gli eriociti infetti vengono opsonizzati, raccogliere le cellule THP-1 per centrifugazione e rimorsi il pellet in 12 millilitri di mezzo di coltura cellulare THP-1 fresco e pre-riscaldato. Dopo una seconda centrifugazione, rimorsi il pellet in un millilitro del mezzo di coltura cellulare THP-1 per il conteggio e regolare la concentrazione cellulare a cinque volte 10 alla quinta cella per millilitro nel mezzo di coltura cellulare THP-1. Rimuovere la soluzione di blocco dalla seconda piastra da 96 porcili e aggiungere 100 microlitri di cellule THP-1 ad ogni pozzo.

Quindi, posizionare il piatto nell'incubatore di coltura cellulare. Alla fine dell'incubazione da opsonizzazione, aggiungere 170 microlitri di mezzo di coltura parassitaria ad ogni pozzo della piastra di opsonizzazione e sedimentare gli eriociti infetti sul fondo della piastra per centrifugazione. Lavare gli eriociti infetti opsonizzati due volte con 200 microlitri di mezzo di coltura parassitaria per pozzo, utilizzando una pipetta multicanale per rimuovere con cura il supernatante dopo il secondo lavaggio.

Resopendare gli eriociti infetti opsonizzati in 100 microlitri di mezzo di coltura cellulare THP-1 pre-riscaldato per pozzo, e trasferire 50 microlitri di ogni sospensione di eriociti infetti opsonizzati in un pozzo corrispondente nella piastra di fagocitosi. Quando tutte le cellule sono state aggiunte, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per non più di 40 minuti, protetto dalla luce. Alla fine dell'incubazione, fermare la fagocitosi per centrifugazione a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet con 150 microlitri di soluzione di litolazione al cloruro di ammonio a temperatura ambiente per pozzo. Dopo esattamente tre minuti, aggiungere 100 microlitri di ghiaccio freddo al 2%FBS in PBS per fermare lalisi e sedimentare le cellule intatte mediante centrifugazione. Successivamente, lavare le celle tre volte con 200 microlitri di ghiaccio fresco freddo 2%FBS in PBS per pozzo, per lavaggio.

Dopo il lavaggio finale, resostigliere il pellet cellulare in 200 microlitri di ghiaccio fresco freddo 2%FBS in PBS per pozzo. Per l'acquisizione e l'analisi della citometria di flusso, caricare immediatamente le cellule su un citometro di flusso e utilizzare il grafico a dispersione laterale lineare avanti e lineare per i pozzi senza eriociti infetti per gateare le cellule THP-1. Acquisire 10.000 eventi in questo gate e utilizzare le cellule THP-1 con gli eriotrociti infetti opsonizzati con un controllo positivo per impostare un grafico istogramma per misurare l'intensità della fluorescenza del bromuro di etidio.

Per l'analisi, aprire il grafico a dispersione laterale lineare in avanti rispetto a quello lineare per i pozzi senza eriociti infetti e gateare le cellule THP-1. Quindi, impostare un gate positivo in un istogramma FL-3 e copiare questi cancelli su tutti gli altri pozzi campione per determinare la percentuale di cellule THP-1 positive al bromuro di etidio. Per ogni campione testato, la fagocitosi può essere riportata come valore assoluto o come fagocitosi relativa calcolata come percentuale utilizzando il controllo positivo come massimo.

Le cellule THP-1 devono essere periodicamente controllate per l'espressione superficiale del recettore gamma FC per citometria del flusso. Le celle devono essere negative per CD16 e positive per CD32 e CD64. In questo esperimento di opsonizzazione, le cellule THP-1 sono state gated per prime in base ai loro profili di dispersione avanti e laterale, per consentire la quantificazione della percentuale di cellule etichettate con bromuro di etidio, indicative di cellule che hanno fagocito almeno un anticorpo opsonizzato eritrocita infetto.

I campioni di controllo negativo dovrebbero tutti generare un singolo picco negativo nel canale FL3, con pochi eventi osservati nel marcatore del bromuro di etidio. Di conseguenza, i valori medi della fagocitosi, sia come cellule THP-1 assolute positive al bromuro di etidio che come percentuali relative di fagocitosi, dovrebbero essere molto bassi. Al contrario, il controllo positivo dovrebbe generare tracce con due picchi, un picco negativo e un picco chiaramente positivo e ben separato situato all'interno del marcatore di bromuro di etidio.

I valori medi della fagocitosi sono normalmente più alti per il controllo positivo, seguiti dal pool femminile esposto alla malaria e dai controlli delle singole donne esposte alla malaria. Sebbene questa metodologia generi risultati coerenti, sono state osservate deviazioni nel coefficiente di pendenza delle linee regolate. Pertanto, si consiglia l'uso di valori relativi, soprattutto se non è possibile eseguire tutti i campioni in un singolo esperimento.

Assicurati di pianificare attentamente l'esperimento in anticipo, preparando sia le cellule THP-1 che i parassiti di conseguenza, utilizzando solo trofociti con una purezza superiore all'80%Inoltre, assicurati di includere sempre i controlli appropriati, per consentire di valutare la qualità dell'esperimento e facilitare l'analisi dei dati.