Isolamento delle cellule CD8 + T residenti nei^reni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Le cellule CD8+T portano caratteristiche distinte in diversi tessuti, come esempio critico di tessuto non mucoso e non linfoide. È essenziale caratterizzare direttamente le cellule renali residenti per comprendere appieno la biologia delle cellule T. Qui dimostreremo il nostro comodo metodo per isolare le cellule CD8 + T residenti nei reni che ospitano la successiva analisi della citometria del flusso.

Questo metodo potrebbe fornire informazioni sugli studi delle cellule CD8+T dell'effettore e della memoria generate dopo le infezioni e sulle risposte autoimmuni. La procedura sarà eseguita dal Dr.Chaoyu Ma, un ricercatore del mio laboratorio. Iniziare diluendo l'anticorpo alfa anti CD8 biotina a 15 microgrammi per millilitro in PBS, assicurandosi che ci sia abbastanza per somministrare 200 microlitri a ciascun topo.

Prima dell'iniezione, riscaldare la vena di coda del mouse con una lampada termica aerea per cinque-10 minuti per dilatarla. Disegnare 200 microlitri della miscela di anticorpi pre-diluiti in una siringa per insulina calibro 28 e rimuovere eventuali bolle d'aria spostando il pistone su e giù. Piegare l'ago per creare un angolo di 150 gradi tra l'ago e la siringa, smussare, in modo che l'ago sia parallelo alla vena della coda.

Trattenere il topo con un limitatore di roditori e spruzzare la coda con il 70% di etanolo per rendere la vena chiaramente visibile. Tenere la coda all'estremità distale con il pollice e le dita medie della mano non dominante, quindi posizionare il dito indice sotto il sito di iniezione. Con la mano dominante inserire l'ago nella vena in parallelo verso la direzione del cuore e iniettare lentamente 200 microlitri dell'anticorpo.

Rimuovere l'ago e comprimere delicatamente il sito di iniezione fino a quando il sanguinamento non si ferma. Dopo aver eutanasiato il topo, sezionare il rene con le forbici e trasferirlo in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri. Lasciare i campioni sul ghiaccio fino a un'ulteriore lavorazione.

Preparare piatti a sei pozzi con tre millilitri di soluzione di digestione in ogni pozzo, usando un pozzo per topo, e conservarli sul ghiaccio. Aggiungere 300 microlitri di soluzione di digestione in ogni tubo campione e tritare i campioni di rene con una forbice a molla dritta. Trasferire i campioni di rene tritati nelle piastre a sei pozzi con la soluzione di digestione.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius con un dondolo delicato per 45 minuti, quindi omogeneizzare il tessuto con la flangia stantuffo di una siringa da tre millilitri e trasferirlo in tubi conici da 15 millilitri. Far girare i campioni a 500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in tre millilitri di RPMI con 10%FCS.

Far girare il campione a 500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti, quindi rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con cinque millilitri di mezzo gradiente di densità del 44% e mix RPMI. Mettere la punta di una pipetta da tre millilitri contenente tre millilitri di mezzo gradiente di densità del 67% e PBS direttamente sul fondo di ogni tubo e rilasciare lentamente la soluzione in modo che la soluzione pesante formi uno strato distinto nella parte inferiore. Ruotare i campioni a 900 volte g per 20 minuti con impostazioni ridotte dell'acceleratore e del freno, quindi rimuovere con cura i tubi dalla centrifuga senza disturbare gli strati.

Rimuovere lo strato superiore con una pipetta di trasferimento senza toccare lo strato di linfocita e trasferire lo strato di linfociti in un nuovo tubo da 15 millilitri. Riempire il tubo con PBS e 5%FCS, quindi mescolare invertendo lentamente il tubo da quattro a sei volte. Dopo aver centrifugato i campioni a 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con 500 microlitri di mezzo RPMI completo.

Le cellule sono ora pronte per la colorazione della citometria a flusso. Anche dopo l'arricchimento dei linfociti mediati dalla centrifugazione della densità, era molto comune vedere gran parte dei non linfociti nel prodotto finale. Tuttavia, dopo aver guadagnato sui linfociti vivi, i linfociti CD8+T erano facili da identificare.

Come previsto, solo le cellule CD8+T extravascolari hanno acquisito in modo efficiente fenotipi di cellule T di memoria residente nei tessuti, come l'upregolazione del CD69 e la downregulation del Ly6C. A differenza dei topi infetti, la stragrande maggioranza delle cellule CD8+T isolate da giovani topi ingenui ospitati nello stabilimento SPF erano etichettate con anticorpi alfa CD8 e quindi appartenevano al compartimento intravascolare. Questa tecnica ha notevolmente accelerato lo studio delle cellule immunitarie residenti nei tessuti negli organi densamente vascolarizzati.