Un modello di loop emodinamico in vitro per indagare l'emocitocompatibilità e l'attivazione delle cellule ospiti dei dispositivi medici vascolari

Questo modello di loop emodinamico consente ai ricercatori di testare la compatibilità emo vitro di dispositivi vascolari come tubi perfusione o stent. in condizioni standardizzate. Quindi questa tecnica non esercita alcun impatto sul sangue con la forza meccanica e quindi evita i risultati fuorvianti per attivazione intrinseca dei componenti del sangue.

Prima di tentare un esperimento, è necessario praticare un corretto assemblaggio meccanico delle parti, una perfetta costruzione del sistema di chiusura ad anello e un lento carico di sangue negli anelli. Per preparare l'assieme loop, utilizzare una fresa a tubo per tagliare pezzi di tubi lunghi 250 centimetri e lunghi cinque millimetri su una superficie piana. E collegare le terminazioni aperte dei tubi in un breve pezzo di tubo di silicio che si adatta al diametro esterno del tubo investigativo per generare una forma ad anello.

Stringere con cura la vite di bloccaggio del connettore della banda di tensione e regolare la forza di chiusura in modo che non rimanga spazio tra le due piegature. Se la vite di bloccaggio è completamente stretta e la tensione della banda in policarbonato sembra troppo bassa per colmare lo spazio tra le due piegature, aprire il sistema di bloccaggio e tagliare alcuni millimetri della banda di tensione. Per preparare un assieme a loop stent, aprire due dei loop e esentare il tubo dal sistema a banda di tensione.

Quindi inserire lo stent al centro del tubo come indicato dal produttore. Una volta generato il numero appropriato di anelli per l'esperimento, fissare i loop nella culla ad anello dell'unità di rotazione, al di fuori di un bagno d'acqua di 37 gradi e attaccare la culla ad anello all'unità di rotazione all'interno del bagno d'acqua. Quindi, riempire una siringa da 10 millilitri per ogni due anelli di sangue da raccogliere con 150 microlitri o soluzione di calcio di eparina preparata al momento e utilizzare una farfalla calibro 21 per raccogliere delicatamente il sangue nelle siringhe, facendo attenzione a evitare l'omolisi o l'attivazione cellulare a causa di un vuoto eccessivo.

Quando tutto il sangue è stato raccolto trasferire il sangue in un bicchiere e utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri, per mescolare delicatamente il sangue e l'eparina. Quando è stata ottenuta una soluzione omogenea con la punta della pipetta non completamente inserita nel tubo, riempire accuratamente ogni anello con cinque millilitri di sangue. Chiudere ogni ciclo dopo che è stato riempito e confermare che il loop, la banda di tensione e il rack sono correttamente fissati.

Quindi ruotare i loop per tre ore a 30 giri al minuto. Al termine della rotazione, lasciare riposare i loop nel rack per due minuti per lasciare che il sangue si accumuli sui fondi dell'anello prima di aprire attentamente i connettori e estrarre il sangue dai duplicati in singoli becher di vetro da 10 millilitri. Quando tutto il sangue è stato raccolto sciacquare ogni tubo con 10 millilitri di PBS e utilizzare un bisturi per tagliare con cura un campione di un centimetro dall'estremità di ogni tubo.

Incubare i campioni durante la notte in glutaraldeide al 2% a quattro gradi celsius, seguita da un'incubazione di 15 minuti e 1%di tetrossido di osmio a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di tetrossido di osmio, disidratare i campioni in una serie crescente di etanolo per 20 minuti per concentrazione, seguita da una disidratazione di 30 minuti nel 100% di etanolo. Al termine dell'incubazione al 100% di etanolo, lasciare asciugare i campioni durante la notte a temperatura ambiente prima di immaginare i campioni scansionando la microscopia elettronica a una tensione di accelerazione di cinque kilovolt, utilizzando uno scanner microTC a raggi X.

Per l'analisi citometrica del flusso dei campioni di sangue. Trasferire 100 microlitri di sangue da ciascun campione in ciascuno dei nove tubi FACS da cinque millilitri e fissare i campioni con l'aggiunta di 100 microlitri di formaldeide di potenza del 4% per tubo per 15 minuti a temperatura ambiente protetti dalla luce. Dopo il lavaggio, sospendere di nuovo ogni pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi per tubo, per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce.

Al termine dell'incubazione, lavare i campioni per centrifugazione in un millilitro di PBS per tubo e posizionare i campioni senza i loro supernaganti sul ghiaccio. Per preparare perline di compensazione a macchia singola aggiungere quattro gocce di perline positive e quattro gocce di perline negative a singoli volumi di un millilitro di tampone FACS e vortice le soluzioni per ottenere sospensioni omogenee di perline. Aggiungere 100 microlitri di ogni soluzione a ciascuno dei quattro o cinque tubi FACS millilitri etichettati come indicato e lavare le perline con un millilitro di tampone FACS per tubo.

Aggiungere quindi 100 microlitri del cocktail di anticorpi vortice appropriato a ogni cocktail sperimentale e fluorescenza meno un tubo con miscelazione delicata. Per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con un millilitro di tampone FACS fresco per campione e resopend pellet in 250 microlitri di tampone FACS per tubo.

Prima di analizzare le perline sui campioni di cellule per citometria a flusso, secondo protocolli standard. Le distribuzioni delle cellule del sangue possono essere visualizzate su tutta la superficie di due bloops spliced mediante microTC e imaging al microscopio elettronico a scansione, mentre non si osservano coaguli in loop chiusi senza spazi vuoti. L'analisi del conteggio delle cellule del sangue intero, non mostra differenze significative nel numero di erociti tra nessuna delle condizioni testate, il numero di piastrine e leucociti, tuttavia, sono drasticamente ridotti nel gruppo del ciclo del lattice e i numeri di emoglobina libera sono drammaticamente aumentati, indicando una biocompatibilità molto scarsa del lattice.

Mentre tutti i dispositivi vascolari testati inducono una maggiore attivazione del sistema di coagulazione e del componente complimento. Gli anelli in PVC rivestiti di eparina mostrano una tendenza alla diminuzione dei livelli di entrambi i tipi di attivazioni rispetto ai loop in PVC rivestiti in polimero. Gli anelli in lattice mostrano i più alti livelli di TNF IL-6 ed elastasi PMN, evidenziando la potente attivazione dei leucociti da parte del lattice.

Le piastrine positive CD41 recuperate dai tubi in lattice, presentano un'intensità di fluorescenza mediana estremamente elevata per CD62P, mentre l'espressione integrata è drasticamente ridotta su granulociti e linfociti. Di interesse, i livelli integrali sono più alti nei monociti dei tubi di lattice, suggerendo interazioni piastrine attivate dal monocito. Infatti la colorazione per aggregati piastrini monociti rivela una maggiore tendenza all'aggregazione in lattice e anelli stent.

Nonostante la ridotta frequenza dei monociti all'interno dei loop in lattice. Per evitare l'attivazione intrinseca dei componenti del sangue è importante garantire una corretta chiusura ad anello e gestire il sangue con cura. Quindi, seguendo questa procedura, è possibile analizzare l'interazione tra proteine allogeniche o TRUCK e componenti del sangue che vengono utilizzati nell'infiammazione o nella ricerca farmaceutica.