Name: Una pipeline bioinformatica per lo studio dellevoluzione molecolare e dellespressione genica usando RNA-seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Scopri una pipeline bioinformatica per analizzare l'evoluzione molecolare e l'espressione genica tramite RNA-seq. Questo metodo utilizza Hydra vulgaris per studiare i geni opsina e la biologia sensoriale.

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Ringraziamo Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad e Aline G. Rangel per i consigli e le indicazioni nell'incorporare alcuni di questi passaggi nel nostro flusso di lavoro. Siamo anche grati a Katherine Williams, Elisabeth Rebboah e Natasha Picciani per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di studio della George E. Hewitt Foundation for Medical research presso A.M.M.

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali uc irvine.
1. Preparazione della libreria RNA-seq
<ol><li>Isolare l'RNA utilizzando i seguenti metodi.<ol>
<li>Raccogliere campioni. Se l'RNA deve essere estratto in un secondo momento, flash congelare il campione o posizionare nella soluzione distoccaggio dell'RNA 15 (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Eutanasia e sezionare l'organismo per separare i tessuti di interesse.</li>
		<li>Estrarre l'RNA totale utilizzando un kit di estrazione e purificare l'RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA(Table of Materials) NOTA: Ci sono protocolli e kit che possono funzionare meglio per diverse specie e tipi di tessuto16,17. Abbiamo estratto l'RNA da diversi tessuti corporei di una farfalla 18 e un'Idra gelatinosa19 (vedi discussione).</li>
		<li>Misurare la concentrazione e la qualità dell'RNA di ciascun campione (Tabella dei materiali). Utilizzare campioni con numeri di integrità dell'RNA (RIN) superiori a 8, idealmente più vicini a 920 per costruire librerie cDNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Costruire la libreria e la sequenza cDNA come segue.<ol>
<li>Creare librerie cDNA in base al manuale di istruzioni di preparazione della libreria (vedere la discussione).</li>
		<li>Determinare la concentrazione e la qualità del cDNA(Tabella dei materiali).</li>
		<li>Multiplex le librerie e sequenziarle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Accedere a un cluster di computer
NOTA: l'analisi RNA-seq richiede la manipolazione di file di grandi dimensioni ed è meglio eseguita su un cluster di computer (Table of Materials).
<ol><li>Accedere all'account cluster del computer utilizzando il comando ssh username@clusterlocation in una finestra dell'applicazione terminale (Mac) o PuTTY (Windows).</li>
</ol>3. Ottenere letture RNA-seq
<ol><li>Ottenere letture RNA-seq dalla funzione di sequenziamento o, per i dati generati in una pubblicazione, dal archivio dati in cui è stato depositato (3.2 o 3.3).</li>
	<li>Per scaricare dati da repository come ArrayExpress, eseguire le operazioni seguenti:<ol>
<li>Cercare nel sito utilizzando il numero di adesione.</li>
		<li>Individuare il collegamento per scaricare i dati, quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse e scegliere Copia collegamento.</li>
		<li>Nella finestra terminale digitare wget e selezionare Incolla collegamento per copiare i dati nella directory per l'analisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per scaricare i dati di NCBI Short Read Archive (SRA), attenersi alla seguente procedura alternativa:<ol>
<li>Nel terminale scaricare SRA Toolkit v. 2.8.1 utilizzando wget. NOTA: il download e l'installazione di programmi nel cluster di computer potrebbe richiedere l'accesso root, contattare l'amministratore del cluster di computer in caso di esito negativo dell'installazione.</li>
		<li>Completare l'installazione del programma digitando tar -xvf $TARGZFILE.</li>
		<li>Cercare in NCBI il numero di adesione SRA per gli esempi che si desidera scaricare, che dovrebbe avere il formato SRRXXXXXX.</li>
		<li>Ottenere i dati RNA-seq digitando [sratoolkit location]/bin/prefetch SRRXXXXXX nella finestra terminale.</li>
		<li>Per i file con estremità accoppiata, digitare [sratoolkit location]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX per ottenere due file fastq (SRRXXXXXX_1.FASTQ e SRRXXXXXX_2.FASTQ). NOTA: per eseguire un assembly Trinity de novo, utilizzare il comando [sratoolkit location]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXXXX
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Tagliare adattatori e letture di bassa qualità (opzionale)
<ol><li>Installare o caricare Trimmomatic21 v. 0.35 nel cluster ing computing.</li>
	<li>Nella directory in cui si trovano i file di dati RNA-seq digitare un comando che includa la posizione del file jar trimmomatico, i file FASTQ di input, i file FASTQ di output e parametri facoltativi come lunghezza e qualità di lettura. NOTA: il comando varierà in base alla qualità e alla lunghezza grezze e desiderate delle letture. Per Illumina 43 bp letture con primer Nextera, abbiamo usato: java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. Fastq $READ 2. Fastq paired_READ1. Fastq unpaired_READ1. Fastq paired_READ2. Fastq unpaired_READ2. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.
</li>
</ol>5. Ottenere l'assieme di riferimento
<ol><li>Cerca google, EnsemblGenomes e NCBI Genomes and Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) per un genoma di riferimento o un trascrittame assemblato per le specie di interesse (Figura 1). NOTA: Se un genoma di riferimento o un trascritoma non sono disponibili o di bassa qualità, procedere al PASSAGGIO 6 per generare un assieme de novo.</li>
	<li>Se esiste un genoma di riferimento o un trascrittame assemblato, scaricarlo come file fasta in cui verrà eseguita l'analisi seguendo i passaggi seguenti.<ol>
<li>Trovare il collegamento per scaricare il genoma, fare clic con il pulsante sinistro del mouse e copiare link.</li>
		<li>Nella finestra terminale digitare wget e incollare l'indirizzo del collegamento. Se disponibile, copiare anche il file GTF e il file FASTA proteico per il genoma di riferimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Generare un assieme de novo (alternativo al passaggio 5)
<ol><li>Combina i file fastq RNA-seq READ1 e READ2 per tutti gli esempi digitando cat *READ1. FASTQ > $all_READ1. FASTQ e gatto *READ2. Fastq > all_READ2. FASTQ nella finestra del terminale.</li>
	<li>Installare o caricare Trinity22 v.2.8.5 nel cluster di elaborazione.</li>
	<li>Genera e genera l'assembly digitando sul terminale: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --right $all_READ2. Funzione FASTQ.
</li>
</ol>7. La mappa legge sul genoma (7.1) o sul trascrittame de novo (7.2)
<ol><li>La mappa legge sul genoma di riferimento usando STAR23 v. 2.6.0c e RSEM24 v. 1.3.0.<ol>
<li>Installare o caricare STAR v. 2.6.0c. rsem v. 1.3.0 al cluster ing computing.</li>
		<li>Indicizzare il genoma digitando rsem-prepare-reference --gtf $GENOME. GTF --stella -p 16 $GENOME. Fasta $OUTPUT.
</li>
		<li>La mappa legge e calcola l'espressione per ogni campione digitando rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1. Fastq $READ 2. Fastq $INDEX $OUTPUT.
</li>
		<li>Rinominare il file dei risultati in qualcosa di descrittivo utilizzando mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
</li>
		<li>Generare una matrice di tutti i conteggi digitando rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mappare l'RNA-seq all'assieme Trinity de novo usando RSEM e bowtie.<ol>
<li>Installare o caricare Trinity22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 e RSEM v. 1.3.0.</li>
		<li>La mappa legge e calcola l'espressione per ogni esempio digitando [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY. FASTA --seqType fq --left $READ 1. FASTQ -- $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --aln_method bowtie --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
</li>
		<li>Rinominare il file dei risultati in qualcosa di descrittivo utilizzando mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
</li>
		<li>Generare una matrice di tutti i conteggi digitando [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[geni/isoforme].results
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Identificare i geni di interesse
NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti con file FASTA nucleotidici o proteici, ma funzionano meglio e sono più semplici con sequenze proteiche. Blast cerca utilizzando proteine e proteine è più probabile che dia risultati durante la ricerca tra diverse specie.
<ol><li>Per un genoma di riferimento, utilizzare il file FASTA proteico di STEP 5.2.2 o vedere Materiali supplementari per generare una funzione genica personalizzata GTF.</li>
	<li>Per un transcriptome de novo, generare una proteina FASTA usando TransDecoder.<ol>
<li>Installare o caricare TransDecoder v. 5.5.0 nel computer cluser.</li>
		<li>Individuare il fotogramma di lettura aperto più lungo e la sequenza peptidica prevista digitando [Posizione transdecoder]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY. Fasta.
</li>
	</ol></li>
	<li>Cerca in NCBI Genbank omologi in specie strettamente correlate.<ol>
<li>Aprire una finestra del browser Internet e passare a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.</li>
		<li>Sulla barra di ricerca digitare il nome del gene di interesse e il nome di specie strettamente imparentate che sono state sequenziate o genere o phylum. A sinistra della barra di ricerca selezionare proteine, quindi fare clic su cerca.</li>
		<li>Estrarre sequenze facendo clic su Invia a e quindi selezionare File. In Formato selezionare FASTA e quindi fare clic su Crea file.
</li>
		<li>Spostare il file FASTA degli omologhi nel cluster di computer digitando scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR in una finestra terminale locale oppure utilizzare FileZilla per trasferire file da e verso computer e cluster.</li>
	</ol></li>
	<li>Cercare geni candidati utilizzando BLAST+26.<ol>
<li>Installare o caricare BLAST+ v. 2.8.1 nel cluster di computer.</li>
		<li>Nel cluster di computer, creare un database BLAST dal genoma o dalla proteina tradotta del trascritta FASTA digitando [POSIZIONE BLAST+]/makeblastdb -in $PEP. Fasta -dbtype prot -out $OUTPUT
</li>
		<li>BLAST le sequenze geniche omologhe da NCBI al database delle specie di interesse digitando [BLAST+ location]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT.</li>
		<li>Visualizzare il file di output utilizzando il comando more. Copia ID gene univoci dalle specie di interesse in un nuovo file di testo.</li>
		<li>Estrarre le sequenze di geni candidati digitando perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP. Fasta > $OUTPUT.
</li>
	</ol></li>
	<li>Conferma l'annotazione genica usando blast reciproco.<ol>
<li>Sul browser Internet vai a https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.</li>
		<li>Selezionare tblastn, quindi incollare le sequenze candidate, selezionare il database delle sequenze proteiche non ridondanti e fare clic su BLAST.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificare geni aggiuntivi annotando tutti i geni nel genoma o nel trascritoma con termini di ontologia genica (GO) (vedi discussione).<ol>
<li>Trasferire la proteina FASTA sul computer locale.</li>
		<li>Scaricare e installare Blast2GO27,28,29 v. 5.2 nel computer locale.</li>
		<li>Aprire Blast2GO, fare clic su File, scegliere Carica, Carica sequenze ,fare clic su Carica file Fasta (fasta). Selezionare il file FASTA e fare clic su Carica.</li>
		<li>Fate clic su Esplosione (Blast), selezionate Esplosione NCBI (NCBI Blast)e fate clic su Avanti (Next). Modificare i parametri o fare clic suAvanti , modificare i parametri e fare clic su Esegui per trovare la descrizione genica più simile.</li>
		<li>Fare clic su mapping, quindi su Esegui per cercare proteine simili nelle annotazioni gene ontologiche.</li>
		<li>Fare quindi clic su interpro, selezionare EMBL-EBI InterProe fare clic su Avanti. Modificare i parametri o fare clicsu Avanti e quindi su Esegui per cercare le firme delle famiglie e dei domini genetici noti.</li>
		<li>Esportare le annotazioni facendo clic su File, selezionare Esporta, fare clic su Esporta tabella. Fare clic suSfoglia , assegnare un nome al file, fare clic suSalva , su Esporta.</li>
		<li>Cercare nella tabella di annotazione i termini di interesse GO per identificare altri geni candidati. Estrarre le sequenze dal file FASTA (STEP 8.4.5)</li>
	</ol></li>
</ol>9. Alberi filogenetici
<ol><li>Scaricare e installare MEGA30 v. 7.0.26 nel computer locale.</li>
	<li>Aprire MEGA, fare clic su Allinea, su Modifica/Allineamento compilazione, selezionare Crea un nuovo allineamento, fare clic su OK, selezionare Proteina.</li>
	<li>All'apertura della finestra di allineamento, fare clic su Modifica, quindi su Inserisci sequenze dal file e selezionare fasta con sequenze proteiche di geni candidati e probabili omologhi.</li>
	<li>Selezionare tutte le sequenze. Trova il simbolo del braccio e passa il mouse su di esso. Dovrebbe dire Allineare le sequenze usando l'algoritmo MUSCLE31. Fare clic sul simbolo del braccio e quindi su Allinea proteine per allineare le sequenze. Modificare i parametri o fare clic su OK per allinearli utilizzando i parametri predefiniti.</li>
	<li>Ispezionare visivamente e apportare eventuali modifiche manuali, quindi salvare e chiudere la finestra di allineamento.</li>
	<li>Nella finestra MEGA principale fare clic su Modelli, fare clic su Trova migliori modelli DNA/Proteine (ML),selezionare il file di allineamento e selezionare i parametri corrispondenti quali: Analisi: Selezione modello (ML), Albero da utilizzare: Automatico (albero adiacente), Metodo statistico: Massima verosimiglianza, Tipo di sostituzione: Amminoacido, Gap/trattamento dati mancanti: Utilizzare tutti i siti, Filtro sito di succursale: Nessuno.
</li>
	<li>Una volta determinato il modello migliore per i dati, vai alla finestra MEGA principale. Fate clic su Filogenesi (Phylogeny), quindi selezionate Albero probabilità massima contruct/test (Contruct/Test Maximum Likelihood Tree), quindi selezionate l'allineamento, se necessario. Selezionare i parametri appropriati per l'albero: Metodo statistico: Massima verosimiglianza, Test di Filogenesi: Metodo Bootstrap con 100 repliche, tipo di sostituzione: amminoacido, modello: LG con Freqs. (+F), tassi tra i siti: gamma distribuita (G) con 5 categorie gamma discrete, trattamento gap/dati mancanti: utilizzare tutti i siti, metodo euristico ML: Nearest-Neighbor-Interchange (NNI).
</li>
</ol>10. Visualizzare l'espressione genica usando TPM
<ol><li>Per Trinity, nel cluster di computer passare alla directory in cui è stato abundance_estimates_to_matrix.pl e uno degli output deve essere matrix. TPM.not_cross_norm. Trasferire il file nel computer locale. NOTA: Vedere Materiali supplementari per la normalizzazione del campione incrociato.</li>
	<li>Per i TPM da un'analisi del genoma seguire i passaggi seguenti.<ol>
<li>Nel cluster di computer passare al percorso di installazione rsem. Copiare rsem-generate-data-matrix digitando scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix. Usa nano per modificare il nuovo file e cambiare "my $offsite = 4" da 4 a 5 per TPM, ora dovrebbe leggere "my $offsite = 5".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passare alla directory in cui si trovano i file di output RSEM .genes.results e ora utilizzare rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT per generare una matrice TPM. Trasferire i risultati in un computer locale.</li>
	<li>Visualizzare i risultati in ggplot2.<ol>
<li>Scaricare R v. 4.0.0 e RStudio v. 1.2.1335 in un computer locale.</li>
		<li>Aprire RStudio a destra dello schermo, passare alla scheda Pacchetti e fare clic su Installa. Digitare ggplot2 e fare clic su installa.</li>
		<li>Nella finestra dello script R leggere nella tabella TPM digitando data<-read.table("$tpm.txt",header = T)
</li>
		<li>Per i grafici a barre simili alla figura 4 digitare qualcosa di simile a: p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity") fill<-c("#d7191c","#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6") p<-p+scale_fill_manual(values=fill) p + theme(axis.text.x = element_text(angolo = 90))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una descrizione dei passaggi per caratterizzare una famiglia genica utilizzando i dati RNA-seq. Questi metodi hanno dimostrato di funzionare per una varietà di specie e set di dati4,34,35. Il gasdotto qui stabilito è stato semplificato e dovrebbe essere abbastanza facile da essere seguito da un principiante della bioinformatica. Il significato del protocollo è che delinea tutti i...

I progressi nelle tecnologie di sequenziamento hanno facilitato il sequenziamento di genomi e trascrittimi di organismi non modello. Oltre alla maggiore fattibilità del sequenziamento di DNA e RNA da molti organismi, è disponibile al pubblico un'abbondanza di dati per studiare i geni di interesse. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire misure bioinformatiche per indagare l'evoluzione molecolare e l'espressione di geni che possono svolgere un ruolo importante nell'organismo di interesse.
Studiare l'evoluzione di un gene o di una famiglia genica può fornire informazioni sull'evoluzione dei sistemi biologici. I membri di una famiglia genica sono tipicamente determinati identificando motivi conservati o sequenze geniche omologhe. L'evoluzione della famiglia genica è stata precedentemente studiata utilizzando genomi di organismi modellolontanamente correlati 1. Una limitazione a questo approccio è che non è chiaro come queste famiglie geniche si evolvano in specie strettamente correlate e il ruolo delle diverse pressioni selettive ambientali. In questo protocollo, includiamo la ricerca di omologhi in specie strettamente correlate. Generando una filogenesi a livello di phylum, possiamo notare tendenze nell'evoluzione della famiglia genica come quella dei geni conservati o duplicazioni specifiche del lignaggio. A questo livello, possiamo anche indagare se i geni sono ortologi o paralogi. Mentre molti omologhi probabilmente funzionano in modo simile l'uno all'altro, questo non è necessariamente ilcaso 2. Incorporare alberi filogenetici in questi studi è importante per risolvere se questi geni omologhi sono ortologi o meno. Negli eucarioti, molti ortologi mantengono funzioni simili all'interno della cellula come evidenziato dalla capacità delle proteine dei mammiferi di ripristinare la funzione degli ortologi di lievito3. Tuttavia, ci sono casi in cui un gene non ortologo svolge una funzione caratterizzata4.
Gli alberi filogenetici iniziano a delineare le relazioni tra geni e specie, ma la funzione non può essere assegnata esclusivamente in base alle relazioni genetiche. Gli studi sull'espressione genica combinati con le annotazioni funzionali e l'analisi dell'arricchimento forniscono un forte supporto per la funzione genica. I casi in cui l'espressione genica può essere quantificata e confrontata tra individui o tipi di tessuto può essere più eloquente della funzione potenziale. Il seguente protocollo segue i metodi utilizzati per studiare i geni opsina in Hydra vulgaris7, ma possono essere applicati a qualsiasi specie e famiglia genica. I risultati di tali studi forniscono una base per ulteriori indagini sulla funzione genica e sulle reti geniche negli organismi non modello. Ad esempio, l'indagine sulla filogenesi delle opsine, che sono proteine che avviano la cascata di fototrasduzione, dà contesto all'evoluzione degli occhi e al rilevamento dellaluce 8,9,10,11. In questo caso, organismi non modello, in particolare specie animali basali come cnidari o ctenofori, possono chiarire la conservazione o i cambiamenti nella cascata di fototraduzione e nella visione attraverso i cladi12,13,14. Allo stesso modo, determinare la filogenesi, l'espressione e le reti di altre famiglie geniche ci informerà sui meccanismi molecolari alla base degli adattamenti.

<table><tbody><tr><td>Kit bioanalizzatore-DNA</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>materiali da laboratorio umidi</td></tr><tr>Kit<td>bioanalizzatore-RNA</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>materiali da laboratorio umidi</td></tr><tr><td>BLAST+ v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td></tr> <tr><td>Blast2GO (sul tuo PC)</td><td></td><td></td><td>Su computer locale https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td></tr><tr><td>boost v. 1.57.0</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer</td></tr><tr><td>Bowtie v. 1.0.0</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td></tr> <tr><td>Cluster di calcolo (altamente consigliato)</td><td></td><td></td><td>NOTA: Le analisi dei dati genomici vengono eseguite al meglio su un cluster di calcolo ad alte prestazioni perché i file sono molto grandi.</td></tr><tr><td>Gemelli v. 2.2.1</td><td></td><td></td><td>Sul cluster di computer</td></tr><tr><td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td><td></td><td></td><td>In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td></tr><tr><td>gcc v. 6.4.0</td><td></td><td></td><td>Sul cluster di computer</td></tr><tr><td>Java v. 11.0.2</td><td></td><td></td><td>Sul cluster di computer</td></tr><tr><td>MEGA7 (sul tuo PC)</td><td></td><td></td><td>Sul computer locale https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MEGAX v. 0.1</td><td></td><td></td><td>Su computer locale https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>Kit NucleoSpin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td>Materiali di laboratorio umidi</td></tr><tr><td>Perl 5.30.3</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer</td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorimetro</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td>materiali da laboratorio umidi</td></tr><tr><td>R v.4.0.0</td><td></td><td></td><td>su cluster di computer https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td></tr> <tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7021</td><td>materiali da laboratorio umidi</td></tr><tr><td>Kit RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>materiali da laboratorio umidi</td></tr><tr><td>RSEM v. 1.3.0</td><td></td><td></td><td>Software per computer https://deweylab.github.io/RSEM/</td></tr><tr><td>RStudio v. 1.2.1335</td><td></td><td></td><td>Su computer locale https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td></tr><tr><td>Samtools v. 1.3</td><td></td><td></td><td>Software per computer</td></tr><tr><td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td></tr><tr><td>STAR v. 2.6.0c</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer https://github.com/alexdobin/STAR</td></tr><tr><td>StringTie v. 1.3.4d</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td></tr> <tr><td>Transdecoder v. 5.5.0</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td></tr><tr><td>Trimmomatic v. 0.35</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Trinity v.2.8.5</td><td></td><td></td><td>Su cluster di computer https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>materiali di laboratorio umidi</td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria di RNA TruSeq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>materiali di laboratorio umidi</td></tr><tr><td>TURBO Kit senza DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>materiali</td></tr> <tr><td></td><td>di laboratorio bagnati</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Il download e l'installazione sul cluster di computer possono richiedere l'accesso root. Contattare l'amministratore di rete.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una pipeline bioinformatica per lo studio dell'evoluzione molecolare e dell'espressione genica usando rna-seq

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distillare e segnalare set di dati di grandi dimensioni, come i dati sull'intero genoma o sul trascrittame, è spesso un compito scoraggiante. Un modo per abbattere i risultati è concentrarsi su una o più famiglie geniche che sono significative per l'organismo e lo studio. In questo protocollo, delineamo i passaggi bioinformatici per generare una filogenesi e quantificare l'espressione dei geni di interesse. Gli alberi filogenetici possono dare un'idea di come i geni si stanno evolvendo all'interno e tra le specie e rivelare l'ortografia. Questi risultati possono essere migliorati utilizzando i dati RNA-seq per confrontare l'espressione di questi geni in diversi individui o tessuti. Studi sull'evoluzione molecolare e sull'espressione possono rivelare modi di evoluzione e conservazione della funzione genica tra le specie. La caratterizzazione di una famiglia genica può servire come trampolino di lancio per studi futuri e può evidenziare un'importante famiglia genica in un nuovo genoma o carta del trascrittame.

I metodi di cui sopra sono riassunti nella figura 1 e sono stati applicati a un insieme di dati di tessuti Hydra vulgaris. H. vulgaris è un invertebrato di acqua dolce che appartiene al phylum Cnidaria che comprende anche coralli, meduse e anemoni di mare. H. vulgaris può riprodursi asessualmente germogliando e possono rigenerare la testa e il piede quando vengono bisessuali. In questo studio, abbiamo mirato a indagare l'evoluzione e l'espressione dei geni...

Lo scopo di questo protocollo è quello di indagare l'evoluzione e l'espressione dei geni candidati utilizzando i dati di sequenziamento dell'RNA.

Una pipeline bioinformatica per lo studio dell'evoluzione molecolare e dell'espressione genica usando RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Questo protocollo delinea i passaggi bioinformatici per indagare l'evoluzione molecolare e l'espressione dei geni candidati. Qui forniamo istruzioni approfondite in modo che chiunque abbia un'esperienza bioinformatica minima possa eseguire questo protocollo. Questa pipeline può essere applicata a qualsiasi organismo e a qualsiasi famiglia genica.Un problema comune quando si fa bioinformatica è che gli script shell non riescono. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi di avere il software più aggiornato, leggere i file di errore e controllare attentamente il manuale. Per iniziare, accedere all'account cluster del computer in un terminale o in una finestra dell'applicazione PuTTY.Sul terminale, scaricare SRA Toolkit versione 2.8.1 utilizzando Wget, quindi completare l'installazione del programma. Cercare ncbi per il numero di adesione SRA per i campioni desiderati, quindi ottenere i dati della sequenza di RNA nella finestra terminale. Ottenere due file FASTQ per il tipo di file con estremità accoppiata.Trova il genoma di riferimento online se ne esiste uno. Per ottenere un assembly di riferimento, digitare wget nella finestra terminale e incollare l'indirizzo del collegamento. Se disponibile, copiare anche il file GTF e il file FASTA proteico per il genoma di riferimento.Indicizza il genoma, quindi mappa le letture e calcola l'espressione per ogni campione. Rinominare il file dei risultati in un valore descrittivo e generare una matrice di tutti i conteggi. Aprire una finestra del browser Internet e passare a NCBI GenBank.Nella barra di ricerca digitare il nome del gene di interesse e il nome delle specie strettamente correlate che sono state sequenziate. A sinistra della barra di ricerca selezionare Proteine e quindi fare clic su Cerca. Estrarre le sequenze facendo clic su Invia a e quindi selezionare File.In Formato selezionare FASTA e quindi fare clic su Crea file. Spostare il file FASTA degli omologhi nel cluster di computer utilizzando una finestra terminale locale o FileZilla. Successivamente, cerca i geni candidati usando BLAST+ Sull'ammasso del computer, crea un database BLAST dal genoma o dalla proteina tradotta con trascrimi, FASTA.BLAST le sequenze geniche omologhe da NCBI al database delle specie di interesse, quindi visualizza il file di output usando di più il comando. Copia ID gene univoci dalle specie di interesse in un nuovo file di testo. Estrarre le sequenze dei geni candidati.Per confermare l'annotazione genica utilizzando Reciprocal BLAST, passare allo strumento di ricerca dell'allineamento locale BLAST, selezionare BLASTP, quindi incollare le sequenze candidate, selezionare il database di sequenze proteiche non ridondanti e fare clic su BLAST. Aprire MEGA, fare clic su Allinea, quindi modificare l'allineamento della compilazione, selezionare Crea nuovo allineamento e quindi fare clic su OK. Selezionare Proteina. Quando viene visualizzata la finestra Allineamento, fare clic su Modifica.Fate clic su Inserisci sequenze da file (Insert Sequences From File) e selezionate fasta con sequenze proteiche di geni candidati e probabili omologhi. Selezionate Tutte le sequenze (All sequences). Trova il simbolo del braccio e passa il mouse su di esso.Dovrebbe dire allineare le sequenze usando l'algoritmo muscolare. Fare clic sul simbolo del braccio e quindi su Allinea proteine per allineare le sequenze Modifica parametri oppure su OK per utilizzare i parametri predefiniti. Questo protocollo è stato applicato ai tessuti di Hydra vulgaris che è un invertebrato d'acqua dolce che appartiene al phylum Cnidaria.I geni Opsin sono stati studiati per comprendere l'evoluzione degli occhi e il rilevamento della luce negli animali. Sequenze per geni correlati all'opsina di H.vulgaris e altre specie sono state estratte in un file FASTA dalla NCBI GenBank. I geni dell'opsina sono stati allineati in MEGA, rendendo possibile identificare le opsine hydra che mancavano di un amminoacido di lisina conservato necessario per legare una molecola sensibile alla luce.Un albero a massima verosimiglianza è stato generato usando sequenze di opsina da Hydra vulgaris e altre specie. La filogenesi suggerisce che i geni dell'opsina si stanno evolvendo per duplicazioni specifiche del lignaggio nei cnidari, e potenzialmente per duplicazione tandem in H.vulgaris. Successivamente, un'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita in edgeR per indagare l'espressione assoluta dei geni opsina.Per determinare se una o più opsine sono regolate in alto nell'ipostoma, o nella testa, sono stati eseguiti confronti a coppie tra ipotoma e colonna corporea, zona in erba, piede e tentacoli. Si scoprì che 1.774 trascrizioni erano espresse in modo differenziato tra l'ipostoma e la colonna corporea. Sono stati determinati i geni che erano regolati in più confronti, ed è stato eseguito un arricchimento funzionale in Blast2GO.Infine, l'espressione assoluta dei geni opsin è stata studiata in diversi tessuti durante diverse fasi di germogliatura e durante diversi punti di rigenerazione del tempo. L'ispezione visiva dell'allineamento e dell'albero confermerà se i geni candidati appartengono alla famiglia di interesse. I geni che sono troppo diversi in sequenza o un gruppo al di fuori di tutto il resto, fanno probabilmente parte di una famiglia genica diversa.I risultati di questo protocollo possono essere considerati generatori di ipotesi. Questa pipeline può evidenziare i geni candidati per studiare funzionalmente negli studi futuri. Dopo aver esplorato l'espressione dell'idra opsina, ora stiamo usando tecniche simili per indagare i geni correlati tra le specie al fine di identificare somiglianze e differenze di funzione.

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