Una pipeline bioinformatica per lo studio dell'evoluzione molecolare e dell'espressione genica usando RNA-seq
28 maggio 2021
Lo scopo di questo protocollo è quello di indagare l'evoluzione e l'espressione dei geni candidati utilizzando i dati di sequenziamento dell'RNA.
Questo protocollo delinea i passaggi bioinformatici per indagare l'evoluzione molecolare e l'espressione dei geni candidati. Qui forniamo istruzioni approfondite in modo che chiunque abbia un'esperienza bioinformatica minima possa eseguire questo protocollo. Questa pipeline può essere applicata a qualsiasi organismo e a qualsiasi famiglia genica.
Un problema comune quando si fa bioinformatica è che gli script shell non riescono. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi di avere il software più aggiornato, leggere i file di errore e controllare attentamente il manuale. Per iniziare, accedere all'account cluster del computer in un terminale o in una finestra dell'applicazione PuTTY.
Sul terminale, scaricare SRA Toolkit versione 2.8.1 utilizzando Wget, quindi completare l'installazione del programma. Cercare ncbi per il numero di adesione SRA per i campioni desiderati, quindi ottenere i dati della sequenza di RNA nella finestra terminale. Ottenere due file FASTQ per il tipo di file con estremità accoppiata.
Trova il genoma di riferimento online se ne esiste uno. Per ottenere un assembly di riferimento, digitare wget nella finestra terminale e incollare l'indirizzo del collegamento. Se disponibile, copiare anche il file GTF e il file FASTA proteico per il genoma di riferimento.
Indicizza il genoma, quindi mappa le letture e calcola l'espressione per ogni campione. Rinominare il file dei risultati in un valore descrittivo e generare una matrice di tutti i conteggi. Aprire una finestra del browser Internet e passare a NCBI GenBank.
Nella barra di ricerca digitare il nome del gene di interesse e il nome delle specie strettamente correlate che sono state sequenziate. A sinistra della barra di ricerca selezionare Proteine e quindi fare clic su Cerca. Estrarre le sequenze facendo clic su Invia a e quindi selezionare File.
In Formato selezionare FASTA e quindi fare clic su Crea file. Spostare il file FASTA degli omologhi nel cluster di computer utilizzando una finestra terminale locale o FileZilla. Successivamente, cerca i geni candidati usando BLAST+ Sull'ammasso del computer, crea un database BLAST dal genoma o dalla proteina tradotta con trascrimi, FASTA.
BLAST le sequenze geniche omologhe da NCBI al database delle specie di interesse, quindi visualizza il file di output usando di più il comando. Copia ID gene univoci dalle specie di interesse in un nuovo file di testo. Estrarre le sequenze dei geni candidati.
Per confermare l'annotazione genica utilizzando Reciprocal BLAST, passare allo strumento di ricerca dell'allineamento locale BLAST, selezionare BLASTP, quindi incollare le sequenze candidate, selezionare il database di sequenze proteiche non ridondanti e fare clic su BLAST. Aprire MEGA, fare clic su Allinea, quindi modificare l'allineamento della compilazione, selezionare Crea nuovo allineamento e quindi fare clic su OK. Selezionare Proteina. Quando viene visualizzata la finestra Allineamento, fare clic su Modifica.
Fate clic su Inserisci sequenze da file (Insert Sequences From File) e selezionate fasta con sequenze proteiche di geni candidati e probabili omologhi. Selezionate Tutte le sequenze (All sequences). Trova il simbolo del braccio e passa il mouse su di esso.
Dovrebbe dire allineare le sequenze usando l'algoritmo muscolare. Fare clic sul simbolo del braccio e quindi su Allinea proteine per allineare le sequenze Modifica parametri oppure su OK per utilizzare i parametri predefiniti. Questo protocollo è stato applicato ai tessuti di Hydra vulgaris che è un invertebrato d'acqua dolce che appartiene al phylum Cnidaria.
I geni Opsin sono stati studiati per comprendere l'evoluzione degli occhi e il rilevamento della luce negli animali. Sequenze per geni correlati all'opsina di H.vulgaris e altre specie sono state estratte in un file FASTA dalla NCBI GenBank. I geni dell'opsina sono stati allineati in MEGA, rendendo possibile identificare le opsine hydra che mancavano di un amminoacido di lisina conservato necessario per legare una molecola sensibile alla luce.
Un albero a massima verosimiglianza è stato generato usando sequenze di opsina da Hydra vulgaris e altre specie. La filogenesi suggerisce che i geni dell'opsina si stanno evolvendo per duplicazioni specifiche del lignaggio nei cnidari, e potenzialmente per duplicazione tandem in H.vulgaris. Successivamente, un'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita in edgeR per indagare l'espressione assoluta dei geni opsina.
Per determinare se una o più opsine sono regolate in alto nell'ipostoma, o nella testa, sono stati eseguiti confronti a coppie tra ipotoma e colonna corporea, zona in erba, piede e tentacoli. Si scoprì che 1.774 trascrizioni erano espresse in modo differenziato tra l'ipostoma e la colonna corporea. Sono stati determinati i geni che erano regolati in più confronti, ed è stato eseguito un arricchimento funzionale in Blast2GO.
Infine, l'espressione assoluta dei geni opsin è stata studiata in diversi tessuti durante diverse fasi di germogliatura e durante diversi punti di rigenerazione del tempo. L'ispezione visiva dell'allineamento e dell'albero confermerà se i geni candidati appartengono alla famiglia di interesse. I geni che sono troppo diversi in sequenza o un gruppo al di fuori di tutto il resto, fanno probabilmente parte di una famiglia genica diversa.
I risultati di questo protocollo possono essere considerati generatori di ipotesi. Questa pipeline può evidenziare i geni candidati per studiare funzionalmente negli studi futuri. Dopo aver esplorato l'espressione dell'idra opsina, ora stiamo usando tecniche simili per indagare i geni correlati tra le specie al fine di identificare somiglianze e differenze di funzione.
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Panoramica
Questo protocollo indaga l'evoluzione molecolare e l'espressione di geni candidati utilizzando dati di sequenziamento dell'RNA, concentrandosi in particolare sui geni dell'opsina in Hydra vulgaris. Lo studio illustra una pipeline bioinformatica applicabile a diversi organismi.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Analisi dell'espressione genica
- Evoluzione molecolare
- Bioinformatica
Sfondo
- Analizza geni candidati rilevanti per la rilevazione della luce e l'evoluzione dell'occhio
- Utilizza l'invertebrato d'acqua dolce Hydra vulgaris
- Impiega risorse del NCBI per il recupero di dati di sequenza
Metodi Utilizzati
- Pipeline bioinformatico per il sequenziamento dell'RNA
- Hydra vulgaris come sistema biologico
- Strumenti come BLAST, MEGA e edgeR per l'analisi
Risultati principali
- Individuati geni dell'opsina che evolvono attraverso duplicazioni specifiche della linea nei Cnidari
- Rilevata un'espressione differenziale di 1.774 trascritti in diverse parti del corpo
- Generato un albero filogenetico di massima verosimiglianza delle sequenze di opsina
Conclusioni
- Il protocollo evidenzia il potenziale dei geni candidati per futuri studi funzionali
- Permette di approfondire la comprensione dell'evoluzione genica e dell'espressione genica in relazione alla biologia sensoriale
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa pipeline di bioinformatica consente un'indagine sistematica dell'evoluzione e dell'espressione delle famiglie geniche, supportando la validazione degli obiettivi attraverso una riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta. Integrando l'analisi filogenetica con la quantificazione mediante RNA-seq, fornisce un grado predittivo di affidabilità per la selezione di geni candidati con funzioni conservate o divergenti tra specie. L'approccio facilita la selezione del portafoglio identificando ipotesi basate su meccanismi prima di destinare risorse a studi funzionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche chiarificando l'ortologia genica e le relazioni evolutive all'interno delle famiglie di geni bersaglio.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale del bersaglio mediante analisi comparativa del profilo di espressione in diversi tessuti e stadi di sviluppo.
- Valore predittivo: Supporta l'identificazione di candidati promettenti evidenziando geni con espansioni specifiche della linea evolutiva e profili di espressione arricchiti in determinati tessuti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara set di geni validati per analisi successive confermando l'appartenenza alla famiglia mediante allineamento delle sequenze e topologia dell'albero filogenetico.
- Valore operativo: Genera matrici di conteggio standardizzate a partire da dati RNA-seq, consentendo output quantitativi riproducibili pronti per saggi analitici.
- Scalabilità: Favorisce il riutilizzo della piattaforma su diversi organismi applicando flussi di lavoro uniformi basati su BLAST, allineamento e analisi filogenetica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i dati di espressione della fase di scoperta ai modelli preclinici identificando pattern di espressione conservati in tessuti rilevanti.
- Allineamento dei Biomarcatori: Supporta la scoperta di biomarcatori traslazionali mediante l'analisi dell'espressione differenziale in diverse condizioni, come ipostomio rispetto alla colonna corporea in Hydra.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Informa le decisioni di proseguimento o interruzione rivelando la dinamica dell'espressione durante le fasi di rigenerazione e gemmazione, indicandone la rilevanza funzionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, consentendo un avanzamento basato su ipotesi, dall'analisi della sequenza al raggruppamento funzionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi generando filogenesi che rivelano eventi di duplicazione e pressioni selettive sulle famiglie geniche di interesse.
- Screening: Fornisce sistemi biologici pronti per saggi attraverso matrici di espressione normalizzate che consentono il confronto incrociato dell'attività genica tra campioni.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti mediante espressione differenziale basata su edgeR, permettendo il confronto statistico tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica identificando geni con ruoli conservati nei sistemi sensoriali attraverso i metazoani.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità bioinformatica riutilizzabile per l'analisi di qualsiasi famiglia genica, riducendo lo sviluppo ridondante di pipeline tra progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione delle target riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso il contesto evolutivo e di espressione.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione mediante procedure bioinformatiche documentate e in passaggi successivi, applicabili tra diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati alle target prima di investire nella validazione in laboratorio.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione corretta rispetto al rischio, evidenziando geni con forte conservazione evolutiva e induzione specifica per tessuto.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in bioinformatica, incluse l'uso di strumenti da riga di comando, database di sequenze e software filogenetici.
- Presuppone l'accesso a infrastrutture computazionali per gestire grandi dataset di RNA-seq ed eseguire analisi BLAST, MEGA ed edgeR.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la nomenclatura dei file, le versioni del genoma di riferimento e le impostazioni dei parametri per l'allineamento e la costruzione degli alberi filogenetici.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica la procedura a organismi non modello con genomi o annotazioni incompleti.
- È limitata dalla qualità e completezza dei dati in ingresso, inclusa la profondità del sequenziamento RNA e l'accuratezza dell'annotazione del genoma di riferimento.
