Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9
10 settembre 2020
CRISPR/Cas9 è sempre più utilizzato per caratterizzare la funzione genica in organismi non modello. Questo protocollo descrive come generare linee knock-out di Culex pipiens, dalla preparazione di miscele di iniezione, all'ottenimento e all'iniezione di embrioni di zanzara, nonché come allevare, incrociare e schermare le zanzare iniettate e la loro progenie per le mutazioni desiderate.
Questo protocollo è significativo perché fornisce istruzioni dettagliate su come preparare e iniettare embrioni di zanzara per l'editing del genoma CRISPR-Cas9. I principali vantaggi di questa tecnica di microiniezione sono che ha un alto tasso di sopravvivenza delle zanzare e consente ai ricercatori di determinare la funzione di un gene. Questo protocollo è stato specificamente studiato per iniettare zanzare che appartengono al genere Culex.
Queste zanzare trasmettono diversi agenti patogeni, tra cui i virus che causano la febbre del Nilo occidentale e l'encefalite di St.Louis, nonché i nematodi filariali, che causano la filariosi cardiopolmonare canina e l'elefantiasi. Pertanto, avere strumenti come l'editing del genoma CRISPR-Cas9, ci permetterà di comprendere e controllare meglio questi importanti fattori della malattia. Iniettare embrioni di insetti appena deposti e ottenere un tasso di sopravvivenza più elevato richiede molto tempo, pratica e pazienza.
Pertanto, si consiglia di iniettare diversi embrioni con una soluzione salina colorata prima di iniettare materiali costosi per generare una mutazione. Inizi riempiendo nuovamente gli aghi per iniezione con la miscela per iniezione. Scegli un riempitivo per aghi o una punta per il caricamento del gel che si adatti facilmente all'estremità posteriore dell'ago per iniezione selezionato.
Assicurarsi che ci sia un po' di spazio tra l'estremità del riempitivo dell'ago e l'ago per iniezione. Aspirare con cautela una singola piccola goccia della miscela per iniezione nell'ago per iniezione vicino al punto in cui inizia a diminuire. Quindi collegare l'ago per iniezione al micro iniettore.
Posizionare il vetrino contenente gli embrioni sul tavolino del microscopio. Per aprire l'ago, utilizzare una pressione di iniezione iniziale di circa 30 Psi e regolarla secondo necessità per erogare un volume appropriato di miscela per iniezione. Sotto un microscopio da dissezione, posizionare l'ago sopra l'embrione di zanzara e utilizzare con attenzione il micromanipolatore per abbassare l'ago sull'embrione.
Una volta che l'ago tocca a malapena l'embrione, sposta rapidamente l'embrione perpendicolarmente all'asse lungo dell'ago. Per determinare se l'ago è stato aperto correttamente, premere il grilletto dell'iniezione e vedere se dall'ago fuoriescono bolle o miscela per iniezione. In caso contrario, ripetere lo spostamento dell'embrione di zanzara contro l'ago fino a quando non è aperto e la miscela per iniezione fuoriesce quando si preme il grilletto.
Posiziona il primo embrione di zanzara al centro del campo visivo, assicurati che sia a fuoco e posiziona l'ago sopra il primo uovo. Aumentare progressivamente l'ingrandimento al microscopio, abbassando con cura l'ago per mantenerlo appena sopra il primo embrione. Procedere fino a quando il microscopio non ha raggiunto il suo massimo ingrandimento e sia l'embrione che l'ago sono a fuoco.
Sposta leggermente l'embrione a sinistra e abbassa l'ago in modo che si trovi sullo stesso piano visivo dell'embrione. Usa il tavolino del microscopio per toccare delicatamente l'embrione con la punta dell'ago. La stretta estremità posteriore dell'embrione di zanzara dovrebbe deviare leggermente.
Utilizzando il tavolino del microscopio, sposta l'estremità posteriore dell'embrione sull'ago e osserva l'ago penetrare nel corion dell'uovo di zanzara. L'ago dovrebbe penetrare nella membrana e nella posizione approssimativa delle cellule polari all'interno dell'embrione. Posizionare la miscela per iniezione in questa regione, aumenta la probabilità che si verifichino mutazioni e vengano ereditate nella linea germinale.
Premi il grilletto dell'iniezione da una a tre volte per sparare la miscela per iniezione nell'embrione. Erogare una piccola quantità di miscela per iniezione, quanto basta per rilevare una piccola schiarita nel plasma embrionale. Usa il tavolino per spostare l'embrione a destra, lontano e fuori dalla punta dell'ago.
Se l'iniezione è andata bene, poco o nessun liquido dovrebbe fuoriuscire dall'embrione. Sposta il tavolino verso il basso in modo che l'embrione successivo sia posizionato davanti all'ago. E ripetere l'iniezione.
Se la miscela per iniezione non sembra fuoriuscire, o se una grande quantità di liquido fuoriesce dall'embrione dopo che l'ago è stato rimosso, sostituire l'ago per iniezione e ricominciare. Distruggi tutte le uova non iniettate o danneggiate. Dopo che tutti gli embrioni sul vetrino sono stati iniettati, lavare via l'olio di alocarburi applicando acqua di osmosi inversa con un flacone a spruzzo.
Dirigere il flusso d'acqua sulla parte superiore del vetrino sopra gli embrioni iniettati e lasciare che l'acqua scorra lungo il vetrino, assicurandosi di non dirigere il flusso sugli embrioni. Coprite il vetrino con 150 microlitri d'acqua e adagiatelo su carta da filtro bagnata all'interno di una capsula di Petri quadrata. Incubare la capsula di Petri in una camera ambientale, impostata a 25-27 gradi Celsius e 70-80% di umidità relativa con un fotoperiodo di lunga durata.
Questo protocollo è stato utilizzato per iniettare con successo embrioni della zanzara domestica settentrionale, Culex pipiens, assicurando che l'estremità anteriore dell'embrione di zanzara si estenda oltre la striscia di medicazione medica, aumentando notevolmente la sopravvivenza larvale e ottenendo una prole di alta qualità in grado di svilupparsi fino all'età adulta e riprodursi. Il sequenziamento ha rivelato che circa il 10% delle zanzare sottoposte a screening mostrava una piccola inserzione o delezione vicino al sito di taglio Cas9 del primo RNA guida, suggerendo che le cellule polari erano state prese di mira con successo durante le micro-iniezioni. Gli individui F1 si sono accoppiati con successo e hanno prodotto una prole vitale, alcuni dei quali contenevano anche la mutazione.
Quando si microiniettano embrioni di insetti, la maggior parte delle persone ha difficoltà ad aprire inizialmente l'ago e a spostare l'embrione sull'ago. Ricorda che lo sviluppo di queste abilità richiede tempo e pratica. Questo protocollo può essere modificato o adattato per iniettare gli embrioni di altre zanzare o anche di altre specie di insetti.
Oltre all'utilizzo di questo protocollo per eliminare i geni con l'editing mirato del genoma CRISPR-Cas9, le stesse tecniche possono essere utilizzate per iniettare plasmidi o trasposoni per knock-in geni o generare mutazioni casuali. Il mio laboratorio sta attualmente utilizzando questa tecnica per capire meglio come le zanzare misurano quotidianamente e regolano le loro risposte stagionali. Tuttavia, come noi ricercatori stiamo utilizzando l'editing del genoma CRISPR-Cas9 per comprendere meglio la biologia di diversi organismi.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per l'uso della modifica del genoma CRISPR/Cas9 per creare linee knock-out di Culex pipiens, una specie di zanzara che trasmette diversi patogeni. Vengono illustrati la preparazione e l'iniezione di embrioni di zanzara, garantendo alti tassi di sopravvivenza e facilitando l'analisi della funzione genica.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito di Ricerca
- Modifica del genoma con CRISPR/Cas9
- Controllo dei vettori e prevenzione delle malattie
- Embriologia degli insetti
Sfondo
- Culex pipiens è un vettore importante per diverse malattie.
- L'identificazione della funzione genica è fondamentale per comprendere la trasmissione dei patogeni.
- Le tecniche di microiniezione aumentano l'efficienza delle modifiche genetiche.
Metodi Utilizzati
- Microiniezione di embrioni di zanzara
- Culex pipiens come modello biologico
- Sistema CRISPR/Cas9 per la modifica mirata del genoma
Risultati principali
- L'iniezione riuscita ha portato a circa il 10% delle zanzare analizzate che presentavano mutazioni mirate.
- Sono stati ottenuti elevati tassi di sopravvivenza delle larve, producendo prole vitale.
- Le mutazioni sono state ereditate attraverso la linea germinale negli individui di F1.
Conclusioni
- Questo studio dimostra la fattibilità dell'uso di CRISPR/Cas9 per studi sulla funzione genica in Culex pipiens.
- Il protocollo ha significative implicazioni per le strategie di controllo dei vettori nella gestione delle malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La modifica genica mediata da CRISPR/Cas9 nei zanzare vettori di malattie consente la validazione di bersagli e la genomica funzionale per studi sulla trasmissione di agenti patogeni. Questo protocollo supporta la riduzione del rischio meccanicistica stabilendo la trasmissione germinale di mutazioni in Culex pipiens, un vettore chiave per il virus del Nilo occidentale e i nematodi filari. L'approccio fornisce una piattaforma scalabile per lo screening fenotipico e l'identificazione di candidati promettenti nella ricerca sul controllo dei vettori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione genica nei vettori di zanzare per convalidare bersagli coinvolti nella trasmissione dei patogeni.
- Valore operativo: Raggiunge un tasso di mutazione di circa il 10% negli embrioni sottoposti a screening, supportando flussi di lavoro efficienti per la convalida dei bersagli.
- Valore predittivo: La trasmissione germinale delle mutazioni nella progenie F1 conferma l'attività sul bersaglio e l'ereditabilità per la valutazione fenotipica.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: La microiniezione di complessi Cas9/gRNA negli embrioni genera mutazioni direzionate a livello di sito per lo screening funzionale.
- Valore operativo: Elevati tassi di sopravvivenza degli embrioni dopo l'iniezione consentono lo screening su larga scala di coorti iniettate.
- Prontezza del saggio: Il protocollo include la preparazione dell'ago, l'allineamento degli embrioni e i parametri di iniezione per garantire la riproducibilità tra diversi esperimenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Le linee mutanti generate permettono lo studio del ruolo dei geni nella competenza vettoriale nei confronti di patogeni come il virus del Nilo occidentale e i nematodi filari.
- De-risking meccanicistico: Le mutazioni ereditate nella linea germinale supportano l'analisi fenotipica longitudinale attraverso le generazioni.
- Sistema rilevante per le malattie: Il modello Culex pipiens consente la valutazione di bersagli genetici rilevanti per le strategie di controllo dei vettori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la validazione del bersaglio, lo screening fenotipico e il successivo approfondimento meccanicistico nei vettori insettici delle malattie.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante knockout genico per chiarire i ruoli nelle vie di trasmissione dei patogeni.
- Screening: Genera letture quantitative delle mutazioni (ad esempio, frequenza di indel) per confrontare l'efficacia dei gRNA e l'efficienza di editing.
- Analisi: Il sequenziamento di individui F0 e F1 fornisce output misurabili per valutare la precisione dell'editing e la trasmissione germinale.
- Ricerca traslazionale: Le linee mutate facilitano la valutazione preclinica della funzione genica nella competenza del vettore e nell'interazione con il patogeno.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo standardizzato di microiniezione può essere adattato a diverse specie di zanzare e modelli di insetti per un riutilizzo della piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso mutazioni trasmissibili alla linea germinale e analisi fenotipica.
- Valore operativo: Elevati tassi di sopravvivenza e parametri di iniezione riproducibili aumentano la produttività e riducono lo spreco di risorse.
- Valore strategico: Consente decisioni di avanzamento o interruzione nella priorizzazione degli obiettivi collegando la funzione genica alla competenza vettoriale.
- Impatto sul portafoglio: Progresso ponderato rispetto ai rischi dei candidati per il controllo dei vettori, basato su approfondimenti meccanicistici validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in embriologia dei zanzare, tecniche di microiniezione e preparazione dei reagenti CRISPR/Cas9.
- Dipende da un apparato di microiniezione, da un sistema microscopico e da controlli ambientali per l'incubazione degli embrioni.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la manipolazione degli embrioni, la pressione di iniezione e la preparazione degli aghi per garantire coerenza.
- L'adattamento ad altre specie di zanzare potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei tempi di raccolta degli embrioni e dei parametri di iniezione.
- I limiti pratici includono la dipendenza dall'abilità tecnica nella preparazione dell'apertura dell'ago e nell'allineamento degli embrioni, che influiscono sulle percentuali di successo delle iniezioni.
