Cristallizzazione delle proteine su chip mediante microdialisi per studi di diffrazione a raggi X in situ

Questo articolo descrive il protocollo di fabbricazione dei chip microfluidici sviluppato per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della dialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. Uno dei principali vantaggi di questi microchip è la scelta dei materiali di fabbricazione, rendendo i chip compatibili per la raccolta dei dati di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. Gli esperimenti di cristallizzazione su chip richiedono piccoli volumi del campione proteico, riducendo il costo complessivo del lavoro con queste macromolecole di alto valore.

La cristallizzazione su chip elimina anche la raccolta manuale dei fragili cristalli proteici, frequentemente applicati in combinazione con il raffreddamento criogenico durante gli esperimenti di cristallografia convenzionali. Inoltre, i nostri microchip utilizzano la microdialisi per la cristallizzazione proteica, che è un metodo basato sulla diffusione che mira ad equilibrare la concentrazione del precipitante attraverso una membrana semi-permeabile, al fine di avvicinarsi alla concentrazione cromulente per la cristallizzazione proteica, e consente un controllo preciso e reversibile sulle condizioni di cristallizzazione. La microdialisi combinata con il controllo della temperatura può essere utilizzata per separare la nucleazione dalla crescita cristallina per studiare i diagrammi di fase, cambiando la concentrazione del precipitante utilizzando lo stesso campione proteico.

Per prima cosa prepara 50 grammi di base in silicone PDMS ed è agente polimerizzante in un rapporto di massa da 10 a uno. Mescolare i due ingredienti in un becher con una spatola. Dopo la miscelazione, posizionare la miscela in una camera a vuoto per rimuovere tutte le bolle d'aria.

Metti 25 grammi del PDMS premiscelato nel primo SU8 per padroneggiare contenente i motivi del canale microfluidico e dei pilastri, fino a un'altezza di circa cinque millimetri. Quindi versare i restanti 25 grammi del PDMS nel secondo master SU8, contenente solo i motivi dei pilastri. Curare i due strati PDMS in forno a 338 kelvin per un'ora.

Tagliare gli strati di PDMS stagionati intorno ai motivi dei maestri SU8 con un bisturi e staccare delicatamente gli stampi PDMS dai maestri del silicone. Posizionare lo stampo PDMS, con sia i canali che i pilastri su uno scivolo rigido in vetro al microscopio con i motivi rivolti verso l'alto. Tagliare un piccolo pezzo di membrana di dialisi della cellulosa rigenerata per coprire il pilastro centrale dello stampo PDMS, progettato per essere la camera proteica.

Il taglio del peso molecolare della membrana di dialisi viene scelto di conseguenza in base al peso molecolare del campione proteico e ai precipitanti della soluzione di cristallizzazione. Quindi separare con cura il pezzo secco della membrana di dialisi della cellulosa rigenerata. Tagliare un piccolo pezzo della membrana di dialisi separata.

La dimensione di questo pezzo di membrana dipende dal design del chip. E in particolare, dipende dalle dimensioni del pilastro centrale. Depositare il pezzo della membrana di dialisi sul pilastro centrale dello stampo PDMS, che è supportato sullo scivolo di vetro, con il suo pilastro e i canali rivolti verso l'alto.

Quindi posizionare il secondo stampo PDMS con solo i pilastri rivolti verso il basso, sopra lo stampo PDMS già supportato sullo scivolo di vetro. Allineare tutti i pilastri dei due stampi PDMS. Il pezzo della membrana di dialisi della cellulosa rigenerata è inserito tra i due pilastri centrali degli stampi PDMS.

Questa fase della procedura di fabbricazione può essere condotta al microscopio ottico o semplicemente ispezionando visivamente attentamente l'allineamento di tutti i pilastri. Posizionare l'assieme in una camera a vuoto e essiccare per 30 minuti al fine di rimuovere le bolle d'aria intrappolate all'interno degli stampi PDMS e migliorare l'inserimento della resina NOA fotocurabile, che verrà descritta nella fase successiva di questo protocollo. Rimuovere l'assieme dalla camera a vuoto e riempire lo spazio vuoto tra i due stampi PDMS con la resina fotocurabile a base di tiolina, NOA 81, per imbibizione capillare.

Applicare la resina su tre dei quattro lati dell'assieme. Posizionare il gruppo in un cross-linker e polimerizzarla esponendo alla luce UV per otto secondi, utilizzando una lampada UV collimata di 35 milliwatt per centimetro quadrato. Tagliare un pezzo PMMA spesso 175 micrometri nelle dimensioni standard di uno scivolo di vetro al microscopio e staccare la protezione plastica da ciascun lato del pezzo PMMA.

Una volta completata la prima esposizione ai raggi UV, rimuovere lo stampo PDMS superiore con una resina NOA parzialmente collegata in modo incrociato bloccata su di essa dallo stampo PDMS inferiore e dallo scivolo di vetro. Premere delicatamente l'assemblaggio dello stampo PDMS superiore e la resina NOA parzialmente polimerizzata sul pezzo PMMA. Posizionare il nuovo gruppo nel cross-linker e curare nuovamente la resina NOA per esposizione alla luce UV per 60 secondi.

Rimuovere con cura lo stampo PDMS superiore. Il chip di dialisi realizzato con la resina NOA completamente incrociata che incorpora una membrana di dialisi della cellulosa rigenerata ed è supportato su un pezzo di PMMA è pronto. Incolla i connettori disponibili in commercio sui punti di ingresso e di uscita del canale microfluidico con colla epossidica veloce.

Per la movimentazione del fluido, scegliere il diametro dei tubi PTFE in base alle dimensioni dei connettori. I tubi sono utilizzati per l'introduzione della soluzione di cristallizzazione all'interno del canale fluidico del chip di dialisi. Pipetta manualmente una goccia del campione proteico all'interno del serbatoio proteico situato proprio sulla membrana di dialisi.

Il volume della goccia proteica dipende dal design del microchip che viene utilizzato. E in particolare, dipende dal volume del pilastro centrale, e può essere 0,1 o 0,3 microlitri. Applicare con cura un sottile strato di grasso siliconico ad alto vuoto intorno al serbatoio proteico.

Tagliare un piccolo pezzo di PMMA e posizionarlo delicatamente sopra lo strato sottile del grasso siliconico. Tagliare un pezzo di nastro Kapton, abbastanza grande da coprire il pezzo pmma posto sopra il serbatoio proteico e attaccare sul chip NOA intorno a tutti i bordi. Il campione proteico è incapsulato all'interno del serbatoio e il chip può essere utilizzato per esperimenti di cristallizzazione.

Preparare innanzitutto circa 500 microlitri della soluzione di cristallizzazione mescolando volumi appropriati del tampone e delle soluzioni precipitanti. Iniettare la soluzione di cristallizzazione nel punto del chip di dialisi attraverso i connettori fluidici, manualmente con la siringa o con un sistema automatizzato a pressione. Una volta riempito il canale fluidico con la soluzione di cristallizzazione e nessuna aria è intrappolata all'interno, sigillare le porte di ingresso e uscita del chip con nastro Parafilm.

Pipettare il volume appropriato della soluzione proteica all'interno del serbatoio proteico e incapsulare il campione proteico come è già stato descritto. La crescita del cristallo proteico può essere visualizzato e registrato con una fotocamera digitale. Per la fabbricazione dei microchip di dialisi, abbiamo scelto materiali otticamente trasparenti e biologicamente inerti, dimostrando un'elevata compatibilità per gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ.

È stato valutato il rumore di fondo generato dai materiali che comprendono il compartimento proteico del chip, che si trova nel percorso diretto del fascio di raggi X. Il compartimento proteico è costituito dalla membrana di dialisi della cellulosa rigenerata, dal nastro Kapton e da due strati di PMMA, uno utilizzato come substrato dei microchip e uno utilizzato per l'incapsulamento del campione proteico. In questa immagine, viene illustrato il rumore di fondo generato dal nastro Kapton, dalla membrana di dialisi della cellulosa rigenerata, dallo strato PMMA e dal loro assemblaggio.

Anche se la resina fotocurabile NOA comprende il corpo principale dei microchip, non è inclusa in queste misurazioni in quanto non fa parte della camera proteica. Anelli diffusi attribuiti alle interazioni dei raggi X con i materiali possono essere visti per il nastro kapton a risoluzione inferiore a quattro angstrom, il PMMA tra i quattro e gli otto angstrom e la membrana di dialisi tra quattro e cinque angstrom. Il rumore di fondo totale generato dal chip si osserva principalmente a una risoluzione inferiore a sei angstrom, indicando che il trattamento dei dati di diffrazione ad alta risoluzione del lysozima non è influenzato.

I microchip sono stati montati davanti al fascio di raggi X con un supporto stampato in 3D che abbiamo progettato per esperimenti di diffrazione a raggi X in situ e può contenere fino a tre chip contemporaneamente. Sono stati condotti esperimenti per valutare l'efficienza dei microchip per la cristallizzazione su chip di proteine solubili in modello con il metodo della microdialisi. I cristalli di lysozima sono stati coltivati a 293 kelvin in due condizioni diverse.

La prima condizione di cristallizzazione conteneva 1,5 cloruro di sodio molare e 0,1 acetato di sodio molare. La seconda condizione di cristallizzazione conteneva un cloruro di sodio molare, 0,1 acetato di sodio molare e il 30% di polietilene glicole 400, ed è stato scelto per mostrare la compatibilità dei microchip e del metodo di microdialisi, con precipitanti ad alto peso molecolare e soluzioni viscose. Gli esperimenti di cristallizzazione sono stati effettuati in condizioni statiche.

Una volta coltivati i cristalli di lisozima sul microchip, sono stati utilizzati per esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. I microchip sono stati montati sulla linea del fascio con l'aiuto del supporto stampato in 3D e i set completi di dati di diffrazione a raggi X sono stati raccolti da due cristalli di lysozima. Dopo il trattamento dei dati di diffrazione dei raggi X, la mappa della densità elettronica di un singolo cristallo di glisozima è stata ottenuta a 1,95 angstrom, come mostrato nella figura A.La figura B mostra la mappa della densità degli elettroni ottenuta con risoluzione di 1,85 angstrom.

Dopo aver unito due set di dati ottenuti da due diversi cristalli di lisozima, entrambe le mappe di elettrodensità mostrano informazioni strutturali dettagliate che possono essere ottenute mediante esperimenti di diffrazione a raggi X in situ condotti direttamente sui microchip di dialisi a temperatura ambiente, da cristalli proteici singoli o multipli. Abbiamo dimostrato la procedura di fabbricazione per dispositivi microfluidici progettati per la cristallizzazione proteica su chip con il metodo della microdialisi e esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. Abbiamo utilizzato materiali di fabbricazione ad alta trasparenza a raggi X, compatibili per la cristallografia proteica in situ.

La raccolta dei dati di diffrazione è automatizzata con l'utilizzo di un supporto stampato in 3D per i chip, che può essere montato direttamente in linee di fascio di cristallografia macromolecolare. La versatilità di questo microchip deriva dall'utilizzo della microdialisi per controllare reversibilmente le condizioni di cristallizzazione e mappare i diagrammi di fase utilizzando un piccolo volume proteico. La prototipazione del dispositivo è semplice, consentendo la fabbricazione di un massimo di 30 microchip in un solo giorno in una stanza pulita, con materiali relativamente economici.

Ci aspettiamo che queste caratteristiche dei chip possano essere utilizzate per studi seriali di cristallografia a raggi X su obiettivi proteici più impegnativi.