Name: Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Scopri come eseguire lo stretching uniaxiale di idrogel 3D con imaging confocale in tempo reale. Questo metodo consente di studiare le risposte biomeccaniche cellulari per applicazioni in ingegneria tissutale e terapie oncologiche.

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Alcune figure incluse qui sono state adattate su autorizzazione del Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Sforzo idrogel 3D con ceppi uniformi dell'asse Z, consentendo al contempo l'imaging di microscopia dal vivo, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo e il protocollo qui presentati si basano in gran parte sul nostro precedente studio di Roitblat Riba etal. 
I principali vantaggi del metodo presentato rispetto agli approcci esistenti includono la possibilità di sforzare idrogel 3D molto morbidi (modulo elastico di ~ 100 Pa) dalla loro circonferenza e sotto imaging confocale dal vivo. Altri metodi sono solitamente limitati nella loro capacità di applicare campi di deformazione nell'asse ...

La risposta dei tessuti alle forze meccaniche è parte integrante di una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui l'espressione genica1,ladifferenziazione cellulare 2e il rimodellamento deitessuti 3. Inoltre, i cambiamenti indotti dalla forza nella matrice extracellulare (ECM) come l'allineamento e la densificazione delle fibre possono influire sul comportamento cellulare e sullaformazione dei tessuti 4,5,6. La struttura in rete fibrosa dell'ECM ha intriganti proprietà meccaniche, come elasticità non lineare, deformazione non affini e deformazioni plastiche7,8,9,10,11,12. Queste proprietà hanno un impatto sul modo in cui le cellule e il microambiente circostante rispondono alleforze meccaniche esterne 13,14. Comprendere come l'ECM e i tessuti rispondono alle forze meccaniche consentirà di progredire nel campo dell'ingegneria tissutale e nello sviluppo di modelli computazionali e teorici più accurati.
I metodi più comuni per allungare meccanicamente i campioni si sono concentrati su substrati 2D carichi di cellule per esplorare gli effetti sul comportamento cellulare. Questi includono, ad esempio, l'applicazione di deformazione ai substrati di polidimetilsilossano (PDMS) e l'analisi degli angoli di riorientamento cellulare in relazione alla direzione diallungamento 15,16,17,18,19. Tuttavia, i metodi che studiano la risposta degli idrogel incorporati in cellule 3D all'allungamento esterno, una situazione che imita più da vicino il microambiente tissutale, sono più limitati. I progressi verso i metodi di stretching 3D sono di particolare importanza perché le cellule si comportano in modo diverso sui substrati 2D rispetto alle matrici 3D20. Questi comportamenti includono riallineamento cellulare, livelli di espressione proteica e modellidi migrazione 21,22,23.
I metodi e i dispositivi che consentono lo stretching del campione 3D includono sia quelli disponibili in commercio24,25,26,27,28 e quelli sviluppati per la ricerca di laboratorio29. Questi metodi utilizzano tubi in silicone distensibili30,camere multi-pozzo31,morsetti26,32,bioreattori11,33,slittenti34,35,36e magneti37,38. Alcune tecniche generano allungamento che deforma localmente gli idrogel 3D, ad esempio tirando aghi da due singoli punti nel gel5, mentrealtre consentono la deformazione dell'intera massa del gel16. Inoltre, la maggior parte di questi sistemi si concentra sull'analisi del campo di deformazione nel piano X-Y, con informazioni limitate sul campo di deformazione nella direzione Z. Inoltre, solo una manciata di questi dispositivi è in grado di imaging microscopico in situ. La sfida principale con l'imaging ad alto ingrandimento in situ (ad esempio, microscopio confocale) è la limitata distanza di lavoro di poche centinaia di micron dalla lente oggettiva al campione. I dispositivi che consentono l'imaging dal vivo durante l'allungamento sacrificano l'uniformità dello sforzo nell'asse Zo sono relativamente complessi e difficili da riprodurre in altri laboratori39,40.
Questo approccio all'allungamento degli idrogel 3D consente un ceppo uniassiale statico o ciclico durante la microscopia confocale viva. Il dispositivo di stretching (indicato come "Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS") è costruito utilizzando parti stampate in 3D e hardware a basso costo, consentendo una facile riproduzione in altri laboratori. Attaccato al dispositivo è una gomma siliconica disponibile in commercio con un ritaglio geometrico al centro. I componenti dell'idrogel sono polimerizzati per riempire il ritaglio. Durante la polimerizzazione, gli idrogel biologici, come la fibrina o il collagene, aderiscono naturalmente alle pareti interne del cut-out. Utilizzando lo SCyUS, la striscia di silicone viene allungata in modo iniessiale, trasferendo ceppi controllati all'idrogel 3Dincorporato 41.
Questo sistema consente una combinazione unica di funzionalità e vantaggi rispetto ad altri metodi esistenti. In primo luogo, il sistema consente lo stiramento uniassiale di idrogel morbidi 3D spessi (>100 μm di spessore, rigidità <1 kPa) dalla loro periferia, con deformazione omogenea Zin tutto l'idrogel. Questi idrogel sono troppo morbidi per essere afferrati e allungati dalle tecniche di trazione convenzionali. In secondo luogo, il dispositivo di stretching può essere facilmente replicato in altri laboratori poiché la stampa 3D è prontamente disponibile per i ricercatori e l'elettronica utilizzata nel design è a basso costo. In terzo luogo, e forse la caratteristica più attraente, la geometria e le dimensioni del ritaglio nella striscia di silicone possono essere facilmente manipolate, consentendo gradienti di deformazione tonnibili e condizioni limite, nonché l'uso di una varietà di volumi di campioni, fino a pochi microlitri.
Il protocollo presentato consiste nello stampaggio del gel di fibrina in dischi di circa 2 mm di diametro in strisce di gomma siliconica spesse 0,5 mm procedenti per tratto uniassiale sotto microscopia confocale viva. Di seguito vengono discusse in dettaglio le procedure sperimentali per misurare e analizzare i ceppi che agiscono sul ritaglio geometrico, i ceppi interni sviluppati nell'idrogel, nonché il conseguente allineamento delle fibre dopo varie manipolazioni elastiche. Infine, viene discussa la possibilità di incorporare cellule nell'idrogel ed esporle a un tratto esterno controllato.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 acido carbossilico, estere succinimidilico</td><td>Invitrogen</td><td>A20002</td><td></td></tr><tr><td>Cell Medium (DMEM High Glucose)</td><td>Biological Industries</td><td>01-052-1A</td><td>Aggiungere 10% FBS, 1% PNS, 1% L-glutammina, 1% Sodium Piruvato</td></tr><tr><td>Cover Slip #1.5</td><td>Bar-Naor Ltd.</td><td>BN72204-30</td><td>22&volte; 40 mm</td></tr><tr><td>DIMETIL SOLFOSSIDO 99,5% GC DMSO</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D-5879-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>EVICEL Sigillante di fibrina (umano)</td><td>Omrix Biopharmaceuticals</td><td>3902</td><td>Fibrinogeno: 70 mg/mL, Trombina: 800-1200 UI/mL</td></tr><tr><td>Fibrinogeno Tampone</td><td>N/A</td><td></td><td>Ricetta per 1L: 7 g di NaCl, 2,94 g di citrato trisodico diidrato, 9 g di glicina, 20 g di arginina cloridrato e 0,15 g di cloruro di calcio diidrato. Portare il volume finale a 1L con PuW (pH 7,0-7,2)</td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti FluoSpheres (1 &micro; m)</td><td>Invitrogen</td><td>F8820</td><td>Arancione (540/560) Fornito in sospensione (2% di solidi) in acqua più 2 mM di sodio azide</td></tr><tr><td>Gomma siliconica per alte temperature</td><td>McMaster-Carr</td><td>3788T41</td><td>580 &micro; m-spessore E = 1,5 Mpa Rapporto di Poisson = 0,48 Resistenza alla trazione = 4,8 MPa Limite superiore di allungamento = +300% di deformazione ingegneristica</td></tr><tr><td>Colonna di desalinizzazione HiTrap 5 mL (Sephadex G-25 imballato)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1408-01</td><td></td></tr><tr><td>HIVAC-G Composto sigillante ad alto vuoto</td><td>Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.</td><td>HIVAC-G 100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ FIJI software39</td><td>National Institute of Health, Bethesda, MD</td><td>Versione 1.8.0_112</td><td></td></tr><tr><td>Microcontrollore (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)</td><td>Arduino/Adafruit</td><td>Arduino-DK001/Adafruit-1438</td><td></td></tr><tr><td>MicroVL 21R Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Primovert Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.</td><td>491206-0011-000</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS CAD (Solidworks)</td><td>Dassault Syst&egrave; mes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS Code37</sup</td><td>>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Servomotore - TowerPro SG-5010</td><td>Adafruit</td><td>155</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrifuga</td><td>Thermo Scientific 75004030</td><td></td><td>Per 50 provette mL</td></tr><tr><td>Sterili 10 cm piastre non di coltura</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per trombina</td><td>N/A</td><td></td><td>Ricetta per 1L: 20 g di mannitolo, 8,77 g di NaCl, 2,72 g di acetato di sodio triidrato, 24 ml di albumina sierica umana al 25%, 5,88 g di cloruro di calcio. Porta il volume finale a 1 litro con PuW (pH 7,0)</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA Soluzione B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Cavo USB Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>(da tipo B maschio a tipo A maschio)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 Microscopio confocale</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>2811000417</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 FP3 (nero)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Release Version 14.0.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

ceppo controllato di idrogel 3d in imaging a microscopia dal vivo

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

Le forze esterne sono un fattore importante nella formazione, nello sviluppo e nella manutenzione dei tessuti. Gli effetti di queste forze sono spesso studiati utilizzando metodi specializzati di stretching in vitro. Vari sistemi disponibili utilizzano barelle basate su substrato 2D, mentre l'accessibilità delle tecniche 3D per filtrare gli idrogel morbidi è più limitata. Qui descriviamo un metodo che consente lo stiramento esterno di idrogel morbidi dalla loro circonferenza, utilizzando una striscia elastica in silicone come portacampcampo. Il sistema di stretching utilizzato in questo protocollo è costruito con parti stampate in 3D ed elettronica a basso costo, rendendolo semplice e facile da replicare in altri laboratori. Il processo sperimentale inizia con idrogel di fibrina morbida spessi (>100 μm) (modulo elastico di ~ 100 Pa) in un ritaglio al centro di una striscia di silicone. I costrutti in silicone-gel vengono quindi attaccati al dispositivo di stiramento stampato e posizionati sullo stadio del microscopio confocale. Sotto microscopia dal vivo viene attivato il dispositivo di allungamento e i gel vengono immagini a varie grandezze di allungamento. L'elaborazione delle immagini viene quindi utilizzata per quantificare le deformazioni del gel risultanti, dimostrando ceppi relativamente omogenei e allineamento delle fibre attraverso lo spessore 3D del gel (asseZ). I vantaggi di questo metodo includono la capacità di filtrare idrogel estremamente morbidi in 3D durante l'esecuzione della microscopia in situ e la libertà di manipolare la geometria e le dimensioni del campione in base alle esigenze dell'utente. Inoltre, con un adeguato adattamento, questo metodo può essere utilizzato per allungare altri tipi di idrogel (ad esempio collagene, poliacrilammide o polietilene glicole) e può consentire l'analisi delle cellule e la risposta dei tessuti alle forze esterne in condizioni 3D più biomimetiche.

I dati rappresentativi provenienti da un tratto statico di magnitudini crescenti applicato alla striscia di silicone che trasporta un idrogel di fibrina 3D, incorporato con perline fluorescenti da 1 μm, sono mostrati nella figura 9. L'analisi dimostra l'effetto dell'allungamento del silicone sui cambiamenti geometrici del cut-out e sui ceppi sviluppati all'interno del gel. Le immagini z-stackdell'intero gel vengono utilizzate per valutare la deformazione del ritaglio origin...

Il metodo presentato prevede lo stiramento uniassiale di idrogel morbidi 3D incorporati nella gomma siliconica, consentendo al contempo la microscopia confocale viva. Vengono dimostrate la caratterizzazione dei ceppi idrogel esterni e interni e l'allineamento delle fibre. Il dispositivo e il protocollo sviluppati possono valutare la risposta delle cellule a vari regimi di deformazione.

Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

I tessuti biologici crescono in ambienti morbidi tridimensionali attraverso i quali le cellule sono esposte a vari segnali meccanici. Il nostro metodo consente l'allungamento degli idrogel in modo tridimensionale per lo studio delle risposte biomeccaniche. Questa tecnica consente l'allungamento uniforme degli idrogel lungo il loro spessore durante l'esecuzione dell'imaging dal vivo.Inoltre, la geometria dell'idrogel può essere manipolata in qualsiasi dimensione o forma. La conoscenza di come le cellule e la matrice extracellulare rispondono alle forze è importante per rivelare come si sviluppano i tessuti e le malattie progrediscono. Ciò può portare a un potenziale sviluppo di terapie antitumorali e modelli di ingegneria tissutale.Inizia utilizzando un laser o una taglierina manuale per creare una striscia di gomma con un foro al centro. Taglia un rettangolo di pellicola idrofobica in modo che sia più larga delle strisce di silicone e lava un piatto di plastica con etanolo al 70%. Dopo l'asciugatura con salviette prive di lanugine, posizionare la pellicola sigillante nel piatto e posizionare una striscia di silicone con l'involucro di plastica rimosso da un lato al centro di ogni pezzo di pellicola sigillante.Per la formazione di gel di fibrina, erogare uniformemente 2,5 microlitri di fibrinogeno marcato a freddo nel ritaglio di silicone di ciascuna striscia in modo che l'intera circonferenza di ciascun ritaglio sia a contatto con il fibrinogeno, facendo attenzione a non consentire la formazione di sacche d'aria o bolle in qualsiasi punto delle soluzioni. Aggiungere immediatamente 2,5 microlitri di trombina raffreddata direttamente a ciascuna soluzione di fibrinogeno e miscelare rapidamente le soluzioni con un accurato pipettaggio, spostando il puntale attorno all'intera miscela per creare una soluzione il più omogenea possibile. Dopo la miscelazione, posizionare il piatto coperto nell'incubatore per 30 minuti per la polimerizzazione del gel.Al termine dell'incubazione, aggiungere una quantità sufficiente di PBS alla piastra per immergere i costrutti di silicone in gel e sollevare con cautela ogni campione dalla capsula, assicurandosi che lo strato di pellicola sigillante rimanga aderente alla striscia. Staccando lentamente da un'estremità all'altra del silicone, staccare con cura la pellicola sigillante da ciascun pezzo di silicone, quindi riposizionare la striscia nel piatto e posizionare il piatto sul tavolino di un microscopio ottico per valutare le condizioni del campione. Per caricare il campione sul dispositivo di allungamento, riempire la vasca con PBS e posizionare la striscia di silicone contenente il gel campione sulla parte superiore della vasca in modo che le estremità della striscia si trovino su ciascun lato della vasca.Posiziona i morsetti e le strisce di tessuto, quindi stringi in modo che tutti i pezzi siano collegati per formare una striscia diritta con il ritaglio al centro. Posizionare il materiale sul pozzetto e fissare un vetrino coprioggetto sul fondo del pozzo, quindi posizionare un pozzetto di liquido di alluminio nel dispositivo di allungamento. Riempire il pozzetto con uno o due millilitri di terreno cellulare PBS e posizionare il gel per tessuti a strisce nel dispositivo.Clamp la striscia di tessuto nella staffa in modo che il ritaglio del gel sia al centro prima di posizionare con cura e bloccare l'inserto del perno in posizione nel dispositivo. Posizionare e bloccare l'altro lato del tessuto nel mandrino e posizionare il dispositivo di allungamento e il campione attaccato sul tavolino di un microscopio confocale. Utilizzare un cavo USB per collegare il microcontrollore al computer e collegare il servomotore al microcontrollore.Quindi aprire il modulo di controllo del dispositivo di allungamento sul computer per visualizzare l'immagine del campione. Per determinare se il campione è adeguato per un esperimento, utilizzare l'imaging dal vivo a bassa risoluzione per scansionare l'intero gel e determinare la posizione Z più bassa in cui è evidente la piena adesione alle pareti interne del ritaglio senza strappi o bolle. Dopo aver annotato la posizione Z del microscopio, scansionare l'interfaccia dell'etichetta fluorescente del gel e della striscia di silicone per determinare la piena adesione del gel al silicone su tutta la sua circonferenza.Dopo la scansione, spostare il tavolino in direzione Z fino a quando non c'è più continuità nel gel e notare il limite superiore della posizione Z. Quindi sottrarre il limite superiore della direzione Z dal limite inferiore per calcolare lo spessore del campione. Per determinare la posizione di pre-stiro del campione, fare clic su Vai a Zero Servo POS nel software del modulo per assicurarsi che il servomotore sia in posizione zero e collegare il servomotore al dispositivo di allungamento, facendo attenzione e non sollecitando il campione.Durante l'imaging, fare clic sul pulsante più uno per spostare il motore di un grado alla volta in senso orario. Quando il lato destro dell'intaglio si sposta, fare clic sul pulsante meno uno per invertire il campione nella penultima posizione per mantenere il campione sotto una tensione minima. Fare clic su Imposta posizione minima servo per impostare la posizione di riferimento e acquisire un'immagine a 40 volte con ingrandimento ad alta risoluzione, a singola porzione di sezione Z dell'intera area del gel come riferimento di base per l'analisi di post-elaborazione.Quando tutte le immagini sono state acquisite, far avanzare il servomotore di un grado al secondo fino a raggiungere l'ampiezza di allungamento desiderata. Ad ogni grandezza di allungamento per la quale si desidera un'analisi, verificare che il gel non si sia staccato dal silicone in nessun punto della sua circonferenza scansionando l'interfaccia tra il gel e il silicone, quindi acquisire un set di immagini Z stack ad alta risoluzione dell'intera area del gel per l'analisi post-elaborazione. Lo zoom avanti e il tracciamento manuale degli aggregati di perline durante l'allungamento del gel consentono di calcolare le deformazioni locali del gel nelle direzioni assiale e perpendicolare.Tipicamente i filamenti assiali si propagano in modo relativamente lineare dal bordo del ritaglio del silicone al centro del gel e sono più grandi delle deformazioni perpendicolari compressive. Qui, vengono mostrate immagini ad alto ingrandimento di un tipico idrogel non allungato e relativamente isotropo e un idrogeno sottoposto a un'elevata deformazione di ritaglio dell'80% che raffigura fibre altamente allineate nella direzione di allungamento. L'analisi del riorientamento delle fibre ha rivelato una dipendenza approssimativamente lineare tra l'allineamento delle fibre e la deformazione esterna sul cutout fino a deformazioni del 40% con saturazione moderata a deformazioni superiori al 40%Come illustrato in questa analisi dell'allineamento delle fibre, all'aumentare della deformazione esterna sul cutout, l'allineamento delle fibre aumenta, seguendo una curva complessiva non lineare.Si noti che la risposta del gel all'allungamento è relativamente uniforme lungo il suo spessore Z. Come illustrato in questa simulazione preliminare agli elementi finiti eseguita su materiale continuo 2D, il tappetino di colore varia dal 38 al 42%, indicando che i ceppi di gel sono relativamente omogenei in tutta l'area circolare del gel. È importante assicurarsi che l'idrogel aderisca completamente alle pareti interne del ritaglio geometrico, poiché l'adesione e la continuità sono fondamentali per un allungamento affidabile dei campioni.Modificando la geometria del ritaglio in silicone, possiamo programmare gradienti di deformazione e allineamento delle fibre, in modo che durante l'incorporamento delle celle possiamo analizzare la risposta a questi gradienti.

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