Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

I tessuti biologici crescono in ambienti morbidi tridimensionali attraverso i quali le cellule sono esposte a vari segnali meccanici. Il nostro metodo consente l'allungamento degli idrogel in modo tridimensionale per lo studio delle risposte biomeccaniche. Questa tecnica consente l'allungamento uniforme degli idrogel lungo il loro spessore durante l'esecuzione dell'imaging dal vivo.

Inoltre, la geometria dell'idrogel può essere manipolata in qualsiasi dimensione o forma. La conoscenza di come le cellule e la matrice extracellulare rispondono alle forze è importante per rivelare come si sviluppano i tessuti e le malattie progrediscono. Ciò può portare a un potenziale sviluppo di terapie antitumorali e modelli di ingegneria tissutale.

Inizia utilizzando un laser o una taglierina manuale per creare una striscia di gomma con un foro al centro. Taglia un rettangolo di pellicola idrofobica in modo che sia più larga delle strisce di silicone e lava un piatto di plastica con etanolo al 70%. Dopo l'asciugatura con salviette prive di lanugine, posizionare la pellicola sigillante nel piatto e posizionare una striscia di silicone con l'involucro di plastica rimosso da un lato al centro di ogni pezzo di pellicola sigillante.

Per la formazione di gel di fibrina, erogare uniformemente 2,5 microlitri di fibrinogeno marcato a freddo nel ritaglio di silicone di ciascuna striscia in modo che l'intera circonferenza di ciascun ritaglio sia a contatto con il fibrinogeno, facendo attenzione a non consentire la formazione di sacche d'aria o bolle in qualsiasi punto delle soluzioni. Aggiungere immediatamente 2,5 microlitri di trombina raffreddata direttamente a ciascuna soluzione di fibrinogeno e miscelare rapidamente le soluzioni con un accurato pipettaggio, spostando il puntale attorno all'intera miscela per creare una soluzione il più omogenea possibile. Dopo la miscelazione, posizionare il piatto coperto nell'incubatore per 30 minuti per la polimerizzazione del gel.

Al termine dell'incubazione, aggiungere una quantità sufficiente di PBS alla piastra per immergere i costrutti di silicone in gel e sollevare con cautela ogni campione dalla capsula, assicurandosi che lo strato di pellicola sigillante rimanga aderente alla striscia. Staccando lentamente da un'estremità all'altra del silicone, staccare con cura la pellicola sigillante da ciascun pezzo di silicone, quindi riposizionare la striscia nel piatto e posizionare il piatto sul tavolino di un microscopio ottico per valutare le condizioni del campione. Per caricare il campione sul dispositivo di allungamento, riempire la vasca con PBS e posizionare la striscia di silicone contenente il gel campione sulla parte superiore della vasca in modo che le estremità della striscia si trovino su ciascun lato della vasca.

Posiziona i morsetti e le strisce di tessuto, quindi stringi in modo che tutti i pezzi siano collegati per formare una striscia diritta con il ritaglio al centro. Posizionare il materiale sul pozzetto e fissare un vetrino coprioggetto sul fondo del pozzo, quindi posizionare un pozzetto di liquido di alluminio nel dispositivo di allungamento. Riempire il pozzetto con uno o due millilitri di terreno cellulare PBS e posizionare il gel per tessuti a strisce nel dispositivo.

Clamp la striscia di tessuto nella staffa in modo che il ritaglio del gel sia al centro prima di posizionare con cura e bloccare l'inserto del perno in posizione nel dispositivo. Posizionare e bloccare l'altro lato del tessuto nel mandrino e posizionare il dispositivo di allungamento e il campione attaccato sul tavolino di un microscopio confocale. Utilizzare un cavo USB per collegare il microcontrollore al computer e collegare il servomotore al microcontrollore.

Quindi aprire il modulo di controllo del dispositivo di allungamento sul computer per visualizzare l'immagine del campione. Per determinare se il campione è adeguato per un esperimento, utilizzare l'imaging dal vivo a bassa risoluzione per scansionare l'intero gel e determinare la posizione Z più bassa in cui è evidente la piena adesione alle pareti interne del ritaglio senza strappi o bolle. Dopo aver annotato la posizione Z del microscopio, scansionare l'interfaccia dell'etichetta fluorescente del gel e della striscia di silicone per determinare la piena adesione del gel al silicone su tutta la sua circonferenza.

Dopo la scansione, spostare il tavolino in direzione Z fino a quando non c'è più continuità nel gel e notare il limite superiore della posizione Z. Quindi sottrarre il limite superiore della direzione Z dal limite inferiore per calcolare lo spessore del campione. Per determinare la posizione di pre-stiro del campione, fare clic su Vai a Zero Servo POS nel software del modulo per assicurarsi che il servomotore sia in posizione zero e collegare il servomotore al dispositivo di allungamento, facendo attenzione e non sollecitando il campione.

Durante l'imaging, fare clic sul pulsante più uno per spostare il motore di un grado alla volta in senso orario. Quando il lato destro dell'intaglio si sposta, fare clic sul pulsante meno uno per invertire il campione nella penultima posizione per mantenere il campione sotto una tensione minima. Fare clic su Imposta posizione minima servo per impostare la posizione di riferimento e acquisire un'immagine a 40 volte con ingrandimento ad alta risoluzione, a singola porzione di sezione Z dell'intera area del gel come riferimento di base per l'analisi di post-elaborazione.

Quando tutte le immagini sono state acquisite, far avanzare il servomotore di un grado al secondo fino a raggiungere l'ampiezza di allungamento desiderata. Ad ogni grandezza di allungamento per la quale si desidera un'analisi, verificare che il gel non si sia staccato dal silicone in nessun punto della sua circonferenza scansionando l'interfaccia tra il gel e il silicone, quindi acquisire un set di immagini Z stack ad alta risoluzione dell'intera area del gel per l'analisi post-elaborazione. Lo zoom avanti e il tracciamento manuale degli aggregati di perline durante l'allungamento del gel consentono di calcolare le deformazioni locali del gel nelle direzioni assiale e perpendicolare.

Tipicamente i filamenti assiali si propagano in modo relativamente lineare dal bordo del ritaglio del silicone al centro del gel e sono più grandi delle deformazioni perpendicolari compressive. Qui, vengono mostrate immagini ad alto ingrandimento di un tipico idrogel non allungato e relativamente isotropo e un idrogeno sottoposto a un'elevata deformazione di ritaglio dell'80% che raffigura fibre altamente allineate nella direzione di allungamento. L'analisi del riorientamento delle fibre ha rivelato una dipendenza approssimativamente lineare tra l'allineamento delle fibre e la deformazione esterna sul cutout fino a deformazioni del 40% con saturazione moderata a deformazioni superiori al 40%Come illustrato in questa analisi dell'allineamento delle fibre, all'aumentare della deformazione esterna sul cutout, l'allineamento delle fibre aumenta, seguendo una curva complessiva non lineare.

Si noti che la risposta del gel all'allungamento è relativamente uniforme lungo il suo spessore Z. Come illustrato in questa simulazione preliminare agli elementi finiti eseguita su materiale continuo 2D, il tappetino di colore varia dal 38 al 42%, indicando che i ceppi di gel sono relativamente omogenei in tutta l'area circolare del gel. È importante assicurarsi che l'idrogel aderisca completamente alle pareti interne del ritaglio geometrico, poiché l'adesione e la continuità sono fondamentali per un allungamento affidabile dei campioni.

Modificando la geometria del ritaglio in silicone, possiamo programmare gradienti di deformazione e allineamento delle fibre, in modo che durante l'incorporamento delle celle possiamo analizzare la risposta a questi gradienti.