Imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite

Qui descriviamo i protocolli per eseguire l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori chemioattrattari nei neutrofili zebrafish

I neutrofili sono importanti cellule infiammatorie che si infiltrano nelle ferite in risposta a ligandi chimici prodotti localmente. Questo protocollo consente la visualizzazione della dinamica dei recettori in risposta a tali ligandi in vivo. L'uso di reporter del recettore delle chemochine potrebbe essere esteso ad altri contesti fisiologici, come modelli di infezione e tumore e ad altre cellule immunitarie.

Il metodo consente di tracciare quando e dove nei tessuti i leucociti percepiscono molecole chemio-attrattive. Ciò può consentire una migliore comprensione di come si sviluppano e si risolvono le risposte immunitarie. L'esecuzione di una ferita della pinna ventrale nelle larve di zebrafish richiede la manipolazione delle larve fini, quindi è necessaria un po' di pratica su larve non destinate a scopi sperimentali.

Dal giorno 2,5 al 3,5 dopo la fecondazione, posizionare le larve di zebrafish anestetizzate sotto un cannocchiale da dissezione fluorescente e selezionare le larve con espressione del recettore transgenico. Trasferire le larve selezionate in una capsula di Petri da 120 millimetri contenente Tricaina integrata con terreno E3 e utilizzare un bisturi sterile per tagliare la pinna ventrale di ciascuna larva abbastanza profonda da causare un sostanziale reclutamento di neutrofili senza tagliare i vasi del tessuto ematopoietico caudale. Aggiungere 500 microlitri di tricaina 2X in un piatto con fondo di vetro, quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di agarosio e mescolare mescolando delicatamente con la punta della pipetta.

Utilizzare una pipetta per trasferire le larve di pesce zebra anestetizzato ferite nel piatto e orientare l'embrione lateralmente spingendo delicatamente verso il basso in modo che la parte caudale del pesce sia il più vicino possibile al fondo di vetro. Quando l'embrione è in posizione, lasciare raffreddare l'agarosio. Dopo 5-10 minuti, toccare delicatamente il gel con un piccolo pennello per confermare la solidificazione e aggiungere due millilitri di terreno E3 integrato con 0,2 milligrammi per millilitro di tricaina alla piastra.

Visualizzare il sito della ferita utilizzando un microscopio confocale a disco rotante. Il prima possibile, dopo che l'agarosio si è solidificato, trasferire l'embrione sulla piattaforma del disco rotante per imaging confocale e utilizzare il joystick del tavolino e l'obiettivo del microscopio per localizzare il pesce. Utilizzando l'obiettivo da 30 a 40X, mettere a fuoco l'area della ferita e selezionare il campo da visualizzare intorno alla ferita.

Seleziona il laser e regola il tempo di esposizione, quindi imposta un timelapse ogni 30 secondi per la durata desiderata e ottieni un'immagine in campo chiaro per documentare il campo visivo. Per quantificare l'internalizzazione del recettore dei neutrofili nel sito della ferita, aprire i set di dati di immagini nelle Fiji e utilizzare il dispositivo di scorrimento temporale per selezionare un intervallo di tempo rappresentativo di interesse per ciascun set di dati. In MATLAB, crea un nuovo script e includi funzioni per la lettura delle immagini, l'apertura e la selezione manuale dei punti di interesse.

Eseguire lo script per aprire il fotogramma di interesse e fare clic sui neutrofili per l'analisi. Registrare una stima dei loro centroidi, sia nella ferita della pinna ventrale che nel tessuto ematopoietico caudale. Segmenta i neutrofili in ogni fotogramma utilizzando la tecnica dei contorni attivi e crea lo script per aggiungere il calcolo della matrice di co-occorrenza del livello di grigio per ciascun neutrofilo, incluso il calcolo del contrasto dei neutrofili in base alla matrice di co-occorrenza del livello di grigio.

Aggiungere comandi per salvare separatamente i valori per i singoli neutrofili nella pinna ventrale, incluso il calcolo del valore medio di contrasto dei neutrofili da tutti i neutrofili del tessuto ematopoietico caudale. Includere la normalizzazione del valore di contrasto dei singoli neutrofili nel sito della ferita al contrasto medio calcolato dei neutrofili del tessuto ematopoietico caudale per ottenere un contrasto normalizzato che rifletta quanto sia punteggiato l'aspetto di un recettore all'interno delle singole cellule che rispondono rispetto alle cellule di controllo che non rispondono. Quindi fare clic su Esegui per eseguire lo script.

L'avvolgimento della pinna ventrale è seguito da una rapida mobilizzazione dei neutrofili dal tessuto ematopoietico caudale nella pinna ventrale e da un raggruppamento al margine della ferita entro 30-60 minuti dall'induzione della lesione. In questa analisi, i recettori delle chemochine CXCR1 e CXCR2 espressi dai neutrofili di zebrafish sono stati ripresi mediante microscopia confocale a disco rotante. Il modello di distribuzione dei recettori è stato quantificato utilizzando la metrica del contrasto, che riporta le differenze di intensità tra i pixel vicini.

Un metodo alternativo consiste nel quantificare il rapporto tra i livelli dei recettori e i livelli di un marcatore di membrana controllato. Utilizzando la metrica di contrasto per rilevare l'internalizzazione del recettore nei cluster di neutrofili sulla ferita, è possibile quantificare le differenze visibili tra il traffico di neutrofili CXCR1 e CXCR2 nel sito della ferita. Ad esempio, in questa analisi, l'internalizzazione di CXCR1 marcata in fluorescenza nelle cellule situate nel sito della ferita è aumentata nel tempo, mentre CXCR2 marcata in fluorescenza è rimasta sulle membrane dei neutrofili nella ferita.

La soppressione dei ligandi CXCR1 e CXCR2 attraverso il trattamento con morfolino provoca l'internalizzazione differenziale di CXCR1 marcata in fluorescenza nel sito della ferita. Inoltre, negli embrioni precoci, CXCR1 marcatamente marcatamente marcatamente internalizzato negli embrioni in cui il ligando del recettore è co-espresso. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'imaging deve essere eseguito il più rapidamente possibile dopo la ferita per catturare la dinamica del recettore durante il reclutamento dei neutrofili nelle ferite.

Dopo l'imaging dei recettori delle chemochine in larve normali, i ricercatori possono eseguire l'imaging comparativo in larve mutanti con infiammazione disregolata.