Name: Imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Scopri l'imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili di zebrafish durante le risposte alle ferite. Questo metodo consente di visualizzare la dinamica dei recettori CXCR1 e CXCR2 in vivo.

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Ringraziamo Christine Holt e Bill Harris per l'aiuto con la microscopia confocale. Ringraziamo Darren Gilmour per i costrutti della spina dorsale del timer fluorescente e Anna Huttenlocher per il vettore backbone Tol2-Lyz. Ringraziamo Steve Renshaw per la linea Tg(mpx:GFP)i114 . Questo lavoro è stato supportato dal MRC (MR/L019523/1), dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e una sovvenzione Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. è stato supportato da un MRC DTP studentship e in parte dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione. H.W. è stato supportato da un MRC DTP Studentship. H.P. è stato supportato da una sovvenzione di dottorato Wellcome Trust (105391 / Z / 14 / Z) e in parte da un Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione e MRC (MR/L019523/1).

<ol><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense%3A+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).</li>
<li>Cotton, M., Claing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+stimulation+and+the+control+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration.</a> Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+regulation+of+neutrophil+migration+by+mitogen-activated+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases.</a> Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).</li>
<li>Wen, X., Jin, T., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+G+Protein-coupled+Receptor-mediated+Chemotaxis+and+its+Signaling+Events+in+Neutrophil-like+HL60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54511(2016).</li>
<li>Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnon%2C+TI+%22Science%22">Science</a>. 333 (6051), 1898-1903 (2011).</li>
<li>Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+CCR2+Activation+in+the+Bone+Marrow+Niche+Mobilizes+Monocytes+by+Desensitizing+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4.</a> PloS One. 10 (6), 0128387(2015).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Donà, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+tissue+migration+through+a+self-generated+chemokine+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient.</a> Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).</li>
<li>Venkiteswaran, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+dynamics+of+an+endogenous%2C+self-generated+signaling+gradient+across+a+migrating+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue.</a> Cell. 155 (3), 674-687 (2013).</li>
<li>Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+receptor+internalization%2C+signaling+level%2C+and+precise+arrival+at+the+target+in+guided+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration.</a> Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).</li>
<li>Yoo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Buchan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+line+for+in+vivo+visualisation+of+neutrophil+myeloperoxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase.</a> PLoS One. 14 (4), 0215592(2019).</li>
<li>Coombs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+trafficking+coordinates+neutrophil+clustering+and+dispersal+at+wounds+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish.</a> Nature Communications. 10 (1), 5166(2019).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Khmelinskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+protein+timers+for+in+vivo+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), 1115(2009).</li>
<li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDetrich%2C+HW+%22The+Zebrafish%3A+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics</a>. , Elsevier. Burlington. (2004).</li>
<li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li>
<li>Chan, T. F., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+contours+without+edges%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Active contours without edges.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 10 (2), 266-277 (2001).</li>
<li>Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Textural+features+for+image+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Textural features for image Classification.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+infection%3A+From+pathogenesis+to+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae%3A+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), 1000562(2010).</li>
<li>Poplimont, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming+in+damaged+tissue+is+orchestrated+by+connexins+and+cooperative+calcium+alarm+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals.</a> Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).</li>
<li>Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Zebrafish+and+CRISPR%2FCas9%3A+Toward+a+more+efficient+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 703(2018).</li>
<li>Kienle, K., Lämmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarming%3A+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li>
<li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52654(2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi

Il metodo descritto consente l'imaging dal vivo della dinamica dei recettori in risposta a ligandi endogeni in situ durante una risposta infiammatoria al danno tissutale. L'uso di reporter neutrofili Cxcr1/Cxcr2 potrebbe essere esteso ad altri contesti fisiologici, come infezioni, modelli tumorali o altri tipi di danno tissutale 14,25,26,27. Inoltre, le linee di salvataggio transgeniche, in cui il recettore endogeno viene soppresso e salvato da un recettore mutante esogeno, potrebbero fornire strumenti utili per analizzare l'importanza di specifici modelli di migrazione dei neutrofili nelle risposte immunitarie. Ad esempio, i mutanti del recettore Cxcr1 che hanno una desensibilizzazione compromessa causano un raggruppamento di neutrofili più prominente nei siti infiammatori14. Questo fenotipo di guadagno di funzione potrebbe essere utilizzato per comprendere il ruolo della congregazione dei neutrofili in diversi processi fisiologici, ad esempio la riparazione delle ferite, le malattie infettive o l'evoluzione del tumore e integrare gli esperimenti di knockdown / knockout del recettore. La metodologia fornisce anche una base per ampliare la gamma di reporter disponibili. La scelta del reporter fluorescente è importante da considerare e dipende dalla questione biologica. Abbiamo scoperto che il turnover costitutivo di questi recettori delle chemochine nei neutrofili era elevato, rispetto alle cellule epiteliali, e che i reporter con maturazione rapida (ad esempio, sfGFP) erano tenuti a riportare i livelli di membrana allo stato stazionario e risolvere le differenze sulla stimolazione dei neutrofili 8,14. Pertanto, i rapporti di membrana di sfGFP / tagRFP non sono applicabili per misurare l'internalizzazione indotta dal ligando in questo tipo di cellula, ma il modello di tagRFP consente il monitoraggio dei destini intracellulari del recettore, che potrebbe essere utile in alcuni studi. Abbiamo anche scoperto che il segnale intracellulare più concentrato di tagRFP è utile per lo screening delle singole larve. Un approccio alternativo per misurare i livelli dei recettori sulla membrana plasmatica sarebbe quello di co-esprimere un marcatore di membrana fluorescente nei neutrofili nello stesso transgene9 o in un transgeneindipendente 14. Nel primo scenario il transgene fornirebbe un ulteriore mezzo per lo screening del pesce e i livelli di espressione sarebbero comparabili tra il marcatore e il recettore. Quest'ultimo approccio sarebbe più modulare, in quanto una linea zebrafish con un reporter recettore potrebbe essere combinata con diverse linee reporter. In entrambi i casi, vale la pena notare che la quantificazione di membrana dei livelli del recettore è difficile nei neutrofili raggruppati (vedi sotto). Infine, notiamo che una possibile estensione di questo protocollo sarebbe quella di seguire l'imaging dal vivo mediante immunoistochimica per analisi di localizzazione più dettagliate.
Il sistema di transgenesi Tol2 è ben consolidato7 e il promotore del lisozima C è stato ampiamente utilizzato per l'espressione dei neutrofili11,15. L'approccio della transgenesi è, quindi, relativamente semplice e il livello di espressione raggiunto con questo promotore è abbastanza alto da fornire un contrasto sufficiente per l'analisi della dinamica del recettore. Una possibile limitazione è che il livello di espressione non ricapitola i livelli di espressione del recettore endogeno. Nuove tecnologie CRISPR potrebbero essere implementate per stabilire linee knock-in per i recettori di particolare interesse28. Queste tecnologie sono ancora ingombranti e potrebbero non garantire i livelli di espressione richiesti per l'imaging subcellulare, ma il loro sviluppo di successo sarebbe un importante passo avanti per la comprensione delle dinamiche di segnalazione endogena. Le convalide funzionali sono importanti per interpretare i dati con costrutti recettoriali transgenici. Ad esempio, i saggi di riconoscimento dei ligandi possono essere utilizzati per stabilire che la proteina di fusione fluorescente è funzionale e il salvataggio dei fenotipi knockout potrebbe essere utilizzato per stabilire che i livelli di espressione transgenica dei neutrofili sono compatibili con la funzionalità14. Infine, un modo più diretto per convalidare la fusione del recettore sarebbe quello di utilizzare un test funzionale in vitro con recettore marcato insieme a versioni non marcate14.
L'approccio di quantificazione affronta difficoltà specifiche nella segmentazione accurata della membrana nei neutrofili in vivo. Nelle cellule di natura epiteliale, la quantificazione dei livelli dei recettori può essere eseguita automaticamente normalizzando i livelli del recettore di membrana in un marcatore di controllo, che può essere espresso in tandem o separatamente9. In effetti, abbiamo applicato un tale approccio, quando abbiamo utilizzato il test di riconoscimento del ligando in embrioni gastrulanti14. Tuttavia, i neutrofili subiscono cambiamenti complessi e rapidi nella forma delle cellule in vivo, rendendo difficile la segmentazione della membrana sia in 2D che in 3D14. Questo è ancora più difficile quando i neutrofili si raggruppano, che si verifica in molti contesti fisiologici29. La metrica di contrasto supera questa limitazione in quanto non richiede la segmentazione della membrana, ma riflette invece lo stato complessivo della distribuzione del recettore nella cellula (membranoso / liscio vs vescicolare / punteggiato). È importante notare che la metrica di contrasto può essere influenzata dal contrasto complessivo dell'immagine, quindi è necessaria la normalizzazione dei valori delle singole cellule a un riferimento interno per tenere conto della variabilità del segnale in diversi embrioni / campioni. Ad esempio, abbiamo usato il valore medio di contrasto cellulare dei neutrofili non responsivi nel CHT (cioè neutrofili che rimangono fermi e non migrano nella pinna ventrale)14. Un'ulteriore possibilità sarebbe quella di normalizzare con i valori di contrasto di un marcatore di controllo nella stessa cella. Ciò fornirebbe una soluzione quando non è disponibile un riferimento interno di cellule non rispondenti e potrebbe probabilmente risolvere differenze quantitative più sottili nella dinamica dei recettori tra condizioni diverse.
La posizione dell'imaging è un'altra variabile da considerare. La ragione per scegliere la ferita della pinna ventrale qui, al contrario del più comunemente usato modello di ferita della pinna caudalemodello 16,30, è perché il sito di ferimento si trova vicino al sito di residenza dei neutrofili / origine migratoria. Ciò accelera la tempistica del test, poiché ci vuole relativamente poco tempo per l'arrivo dei neutrofili. Inoltre, offre l'opportunità di catturare il comportamento cellulare sia all'origine della migrazione (CHT) che nella posizione di interesse target (ferita). Questo è rilevante qui, perché la risoluzione spaziale e temporale richiesta per l'imaging subcellulare è difficile da combinare con un ampio campo visivo o una scansione multi-posizione. Pertanto, il test della ferita della pinna ventrale consente di tracciare l'evoluzione della risposta migratoria dall'origine della migrazione e la cattura simultanea di fluttuazioni non specifiche del recettore nelle cellule che non rispondono. Come accennato in precedenza, quest'ultimo è utile ai fini della quantificazione in quanto fornisce un riferimento interno per dinamiche non specifiche. In altri sistemi, potrebbe non essere possibile avere un tale riferimento interno, nel qual caso i valori di contrasto di un marcatore a membrana coespresso fornirebbero un controllo alternativo.
In sintesi, prevediamo che la metodologia è applicabile ad altri sistemi e può essere implementata per una varietà di scopi. Ad esempio, gli stessi reporter potrebbero essere utilizzati in altri contesti infiammatori, come le impostazioni di infezione o altri modelli di malattia. Il repertorio delle linee reporter del recettore zebrafish potrebbe essere esteso ad altri recettori di segnalazione, per comprendere i meccanismi di segnalazione o segnalare le dinamiche del ligando in vivo. L'approccio può essere combinato con tecniche di knockdown/knockout per interrogare le basi meccanicistiche delle dinamiche osservate. Ad esempio, la perturbazione dell'espressione del ligando può indicare la dipendenza dal ligando per le dinamiche dei recettori osservate. In futuro, prevediamo che il sistema potrebbe essere ulteriormente perfezionato per incorporare l'inserimento knock-in dei giornalisti. In definitiva, i risultati che utilizzano questa metodologia fornirebbero nuove intuizioni preziose al di là della comunità dei pesci zebra, data la conservazione di questi recettori di segnalazione nei mammiferi e la relativa sfida di condurre questi studi in organismi più grandi.

La migrazione dei leucociti è di fondamentale importanza per le risposte immunitarie. Le cellule immunitarie sono cellule migratorie prototipiche, che sono notevolmente in grado di attraversare tessuti e vasi sanguigni e di percepire una serie di segnali di guida chimica per migrare direzionalmente verso microbi o altre cellule ospiti importanti. Una guida corretta si basa sul riconoscimento dei chemioattrattivi, tra cui le chemochine rappresentano la categoria1 più importante. Le chemochine sono riconosciute da recettori accoppiati a sette proteine G transmembrana altamente specifici. Al momento del legame con le chemochine, i recettori delle chemochine cambiano conformazione portando all'attivazione delle proteine G trimeriche associate e alla loro dissociazione in subunità di segnalazione funzionale che promuovono i cambiamenti citoscheletrici e la migrazione diretta1. Secondariamente, i recettori delle chemochine sono fosforilati e questa modifica porta alla desensibilizzazione all'attrattivo, che può essere seguita da una rapida risensibilizzazione / riciclaggio o degradazione intracellulare e down-regolazione dalla superficie cellulare2. Queste dinamiche dei recettori influenzano la durata e la dose di segnalazione ricevuta dalle cellule, ma il modo in cui influenzano il comportamento di migrazione dei leucociti è stato difficile da chiarire in vivo.
Il monitoraggio delle dinamiche dei recettori nei leucociti vivi nei sistemi tradizionali dei mammiferi deve affrontare diverse sfide. Per gli studi dal vivo, le fusioni di recettori con proteine fluorescenti devono essere espresse nelle cellule. Questo è difficile nei leucociti primari, in particolare nei neutrofili, e gli studi finora hanno utilizzato linee cellulari neutrofile surrogate per esprimere i recettori delle chemochine 3,4. La generazione di modelli murini transgenici, in cui i leucociti esprimono un recettore fluorescente o recettori mutanti con difetti di traffico informativo 5,6, comporta un notevole investimento di tempo e risorse. Anche in questi casi, la risoluzione e il contrasto di imaging per le dinamiche dei recettori di imaging nell'animale vivo possono essere limitati e gli studi hanno utilizzato l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse5. Date queste sfide tecniche, la nostra comprensione di come le dinamiche dei recettori chemioattrattivi influenzano il comportamento cellulare in un ambiente di tessuto vivo è attualmente limitata.
Qui forniamo una metodologia per monitorare il traffico di recettori nei neutrofili zebrafish. I pesci zebra sono geneticamente trattabili, come i topi, ma la transgenesi è relativamente più semplice attraverso l'uso di sistemi di trasposoni efficienti e la manipolazione diretta dello zigote7. La larva trasparente è idealmente suscettibile di imaging. Le dinamiche del recettore delle chemochine sono state visualizzate nelle cellule germinali primordiali e nella linea laterale primordium mediante espressione di fusioni corrispondenti con reporter fluorescenti 8,9,10. Le larve di zebrafish sono dotate di neutrofili maturi che hanno proprietà genetiche e cellulari altamente conservate rispetto ai neutrofili dei mammiferi. Le dinamiche di segnalazione subcellulare come la dinamica citoscheletrica e i regolatori di polarità sono stati visualizzati in queste cellule mediante la generazione di corrispondenti linee transgeniche 11,12,13. Recentemente, abbiamo visualizzato e analizzato funzionalmente le dinamiche del recettore delle chemochine nei neutrofili durante il corso delle risposte infiammatorie al danno tissutale14. Qui, descriviamo la generazione di linee reporter transgeniche per la segnalazione di chemochine nei neutrofili, la preparazione di embrioni per l'imaging dal vivo, un test delle ferite per lo studio della segnalazione dei neutrofili e il protocollo per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. Forniamo anche un protocollo laterale per testare le risposte dei recettori delle chemochine ai ligandi candidati, che è utile quando si cerca di stabilire modelli di riconoscimento dei ligandi in recettori non caratterizzati. Queste tecniche possono essere utilizzate in combinazione con ulteriori manipolazioni genetiche, come l'inibizione dell'espressione di chemochine endogene o la generazione di recettori mutanti con traffico alterato indotto dal ligando, per interrogarsi su come specifiche dinamiche di segnalazione influenzano il comportamento dei leucociti in vivo. Le linee transgeniche che esprimono recettori delle chemochine marcati fluorescentemente possono anche essere utilizzate come reporter per gradienti di chemochine endogene, che sono altrimenti difficili da rilevare mediante colorazione diretta degli anticorpi. La metodologia descritta fornisce la possibilità di espandere la generazione di reporter ad altri recettori di immuno-segnalazione.

<table><tbody><tr><td>1-fenil-2-tiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Centrifuga Tubo</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark vetro capillare</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Cannocchiale da dissezione</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore a blocco Dri</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincipe, Gioielleria Dumont n. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per micropozzetti con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta pasteur in vetro</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizione</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microiniezione</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette per microcaricatori</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Disco rotante UltraVIEW ERS, Olympus IX81 Disco rotante Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>N/A Petri</td><td></td></tr><tr><td>dish (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pennello piccolo</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr> Ricerca <tr><td>applicata spettrale Modulo laser</td><td></td> LMM5 <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi chirurgico n. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Software Volocity</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Scanner confocale a disco rotante Yokogawa CSU10</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

La guida dei leucociti da parte di gradienti chimici è essenziale per le risposte immunitarie. I neutrofili sono le prime cellule ad essere reclutate in siti di danno tissutale dove eseguono funzioni antimicrobiche cruciali. Il loro traffico verso questi loci è orchestrato da diversi chemioattrattivi infiammatori, tra cui le chemochine. A livello molecolare, la segnalazione chemioattrattante è regolata dal traffico intracellulare dei recettori corrispondenti. Tuttavia, non è chiaro come i cambiamenti subcellulari nei recettori delle chemochine influenzino le dinamiche di migrazione dei leucociti a livello cellulare e tissutale. Qui descriviamo una metodologia per l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori delle chemochine nei neutrofili durante le risposte infiammatorie al danno tissutale. Questi strumenti hanno rivelato che il traffico differenziale del recettore delle chemochine nei neutrofili del pesce zebra coordina il raggruppamento e la dispersione dei neutrofili nei siti di danno tissutale. Ciò ha implicazioni per la nostra comprensione di come le risposte infiammatorie sono auto-risolte. Gli strumenti descritti potrebbero essere utilizzati per comprendere i modelli di migrazione dei neutrofili in una varietà di contesti fisiologici e patologici e la metodologia potrebbe essere estesa ad altri recettori di segnalazione.

La ferita della pinna ventrale è seguita da una rapida mobilizzazione dei neutrofili dal CHT nella pinna ventrale e dal raggruppamento al margine della ferita, entro 30-60 minuti (Figura 1). Abbiamo visualizzato la distribuzione di due recettori delle chemochine, Cxcr1 e Cxcr2, che sono espressi dai neutrofili zebrafish24 e riconoscono Cxcl8a e Cxcl8b14, usando la microscopia confocale a disco rotante. Abbiamo generato due linee transgeniche corrispondenti, Tg(lyz:Cxcr1-FT) e Tg(lyz:Cxcr2-FT), in cui i neutrofili esprimono un costrutto timer fluorescente (FT) del recettore, cioè una fusione con un tandem di sfGFP e tagRFP (Figura 2 e riferimento14). L'uso dei due fluorofori aveva lo scopo di consentire il monitoraggio di un'ampia gamma di destini recettoriali e fornire stime del tempo di turnover proteico sulla membrana plasmatica, poiché i recettori di nuova sintesi fluorescevano in verde e diventavano progressivamente rossi all'età di 8,14 anni. Tuttavia, questi recettori hanno un rapido turnover costitutivo sulla membrana plasmatica dei neutrofili e che il tempo di permanenza era più breve del tempo di maturazione di tagRFP, con sfGFP che mostrava localizzazione di membrana e tagRFP che mostrava localizzazione vescicolare allo stato stazionario (Video supplementare 1 e ref14). Pertanto, ci siamo concentrati sulla distribuzione di sfGFP per monitorare l'internalizzazione indotta dal ligando nei siti di danno tissutale. Il modello di distribuzione del recettore è stato quantificato utilizzando la metrica di contrasto, che riporta le differenze di intensità tra i pixel vicini. La logica è che quando la distribuzione del recettore è membranosa e liscia, il valore di contrasto è basso. Quando la distribuzione del recettore è vescicolare e più puntina, il valore di contrasto è alto (Figura 3).
Un metodo alternativo consiste nel quantificare il rapporto tra i livelli dei recettori (intensità sfGFP) rispetto ai livelli di un marcatore di membrana di controllo, ad esempio la CFP di membrana (mCFP) (Figura 3). Entrambi i metodi potrebbero rilevare l'internalizzazione del recettore, come indicato da un modello di distribuzione del recettore vescicolare più globale nella cellula (valore di contrasto più elevato) o livelli di recettori più bassi sulla membrana (rapporto sfGFP / mCFP inferiore). Tuttavia, la metrica di contrasto potrebbe anche rilevare l'internalizzazione del recettore nei cluster di neutrofili alla ferita, in cui la segmentazione della membrana era meno accurata e non applicabile (Figura 3). Utilizzando questa metrica, siamo stati in grado di quantificare le differenze visibili tra il traffico di neutrofili Cxcr1 e Cxcr2 nelle ferite (Figura 4 e Video supplementare 2). Cxcr1-FT interiorizzato in cellule situate nella ferita mentre Cxcr2-FT è rimasto membranoso nei neutrofili nella ferita (Figura 4A-C, Video supplementare 2 e Video supplementare 3). La soppressione di Cxcl8a e Cxcl8b, attraverso il trattamento con morfolino, ha influenzato in modo differenziale l'internalizzazione di Cxcr1-FT alle ferite (Figura 4C,D). Per convalidare ulteriormente che Cxcr1-FT risponde a Cxcl8a, abbiamo eseguito saggi di risposta alle chemochine negli embrioni precoci. Abbiamo scoperto che Cxcr1-FT è marcatamente interiorizzato in embrioni in cui Cxcl8a è stato co-espresso (Figura 5). Complessivamente questi risultati indicano che i metodi descritti possono essere utilizzati per misurare l'internalizzazione del recettore indotta da chemochine nei neutrofili e stabilire l'identità del ligando mediando questi effetti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migrazione dei neutrofili alle ferite delle pinne ventrali. (A) (A sinistra) Vignetta della larva di 3 dpf che mostra la posizione del tessuto ematopoietico caudale (CHT), la circolazione di Venere (VC, blu), la pinna ventrale (VF) e il sito della ferita. (Destra) Cartone animato raffigurante l'area della ferita (W) con i neutrofili che vengono mobilitati dal CHT e raggruppati sulla ferita. Il plesso della vena caudale (CVP) del tessuto CHT è disegnato in blu. (B) Immagine in campo luminoso (a sinistra) e proiezione confocale (a destra) che mostra la ferita della pinna ventrale e la distribuzione dei neutrofili nelle larve di Tg(mpx:GFP) a 2 ore dopo l'avvolgimento. Le linee tratteggiate mostrano i contorni VF e CHT. Barra della scala = 25 μm. Immagine cartoon e fluorescente modificata dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imaging dal vivo del traffico del recettore delle chemochine nei neutrofili. (A) Costrutti utilizzati per l'espressione transgenica neutrofila-specifica di Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) e Cxcr2-FT. Proiezioni confocali di neutrofili nella testa di una larva transgenica 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), top; Tg(lyz:Cxcr2-FT), in basso) che mostra i canali tRFP (magenta) e sfGFP (verde). Barra di scala = 20 μm. (B) Schema anatomico di 3 larve dpf come in Figura 1A. Sotto la larva ci sono schemi che raffigurano l'area della ferita (W) con i neutrofili che vengono mobilitati dal CHT (in alto) o eseguono la chemiotassi quando entrano nella pinna ventrale (in basso). Il quadrato tratteggiato indica l'area ripresa nelle istantanee a destra. (C) Neutrofili nelle larve di Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP è mostrato) dopo mobilizzazione dal CHT (pannelli superiori) o chemiotassi verso la ferita (pannelli inferiori). Le frecce mostrano le stesse celle nel tempo. I punti temporali sull'immagine a destra sono minuti trascorsi dopo l'immagine a sinistra. Barra di scala = 10 μm. (D) Rappresentazione schematica dell'approccio sperimentale per l'imaging dal vivo del traffico del recettore delle chemochine. Pannelli A-C modificati dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Esempi di quantificazione della dinamica dei recettori. I neutrofili singoli (blu) o raggruppati (verde) alle ferite o i neutrofili non mobilizzati nel CHT (rosso, arancione) sono stati segmentati e analizzati con metodi diversi per confrontare i risultati. Le stesse celle di esempio mostrate sono state analizzate con due metodi per mettere in relazione ciò che si vede nell'immagine con l'intervallo di valori estratti. (A) La superficie delle celle di esempio selezionate è stata segmentata in base alla definizione del contorno nel canale sfGFP. (B) Il contrasto è stato calcolato dalle celle di esempio mostrate in A. (C) La membrana delle cellule di esempio selezionate è stata segmentata in base alla definizione del contorno nel canale CFP. È seguita l'analisi raziometrica di sfGFP/CFP. (D) Il rapporto sfGFP/CFP è stato calcolato sulle celle di esempio mostrate in C. Le barre di errore rappresentano S.E.M. da singole celle, nei casi di n&gt;1, i valori qui non sono stati utilizzati per analisi statistiche ma semplicemente per esemplificare le misurazioni ottenute con i diversi metodi di quantificazione. Barra della scala = 10 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinamica differenziale di Cxcr1 e Cxcr2 in risposta al ferimento. (A) Proiezione confocale di neutrofili in larve Tg(lyz:Cxcr1-FT) o Tg(lyz:Cxcr2-FT) alla ferita a 80 minuti dopo l'avvolgimento (canale sfGFP mostrato). Barra della scala = 10 μm.  (B) Neutrofilo Cxcr1-FT ingrandito (a sinistra) e Cxcr2-FT (a destra) alla ferita. Il recettore verde è mostrato in grigio. Barra di scala = 5 μm. (C) Contrasto normalizzato (contrasto per singolo neutrofilo normalizzato al contrasto medio delle cellule non mobilizzate nel CHT). cxcl8a si riferisce all'iniezione di un blocco di giunzione insieme a un morfolino che blocca la traduzione per cxcl8a. cxcl8b si riferisce all'iniezione con un morfolino che blocca la giunzione per cxcl8b. Per Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 cellule (CHT), n=47 cellule (ferita) da 8 larve. Per Tg(lyz:Cxcr1-FT) con morfolinos: n=28 cellule (Cxcl8a-MO) da 5 larve, n=16 cellule (Cxcl8b-MO) da 5 larve. Per Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 cellule (CHT) e n=20 cellule (ferita) da 3 larve. I dati sono stati raggruppati da larve indipendenti acquisite in 1-5 sessioni di imaging. Test di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn per Tg (lyz: Cxcr1-FT), test di Mann-Whitney spaiato a due code per Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Proiezione confocale di neutrofili in larve transgeniche Tg(lyz:Cxcr1-FT) trattate con cxcl8a morpholino (MO) (a sinistra) e cxcl8b MO (a destra) che rispondono alle ferite delle pinne (canale sfGFP mostrato in verde). Istantanea scattata in punti temporali di accumulo equivalente di neutrofili (85 minuti post-ferimento nell'immagine sinistra e 45 minuti post-ferimento nell'immagine destra). Barra della scala = 10 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Test di risposta alle chemochine negli embrioni precoci. Fette confocali a scansione laser di embrioni gastrulanti che mostrano espressione e distribuzione di Cxcr1-FT. 100 pg di mRNA Cxcr1-FT sono stati iniettati in uova a stadio cellulare con o senza mRNA Cxcl8a 150 pg. I recettori verdi e rossi sono mostrati in canali separati. Il marcatore CFP a membrana di controllo (mCFP) viene mostrato nel canale ciano. Barra della scala = 20 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Film supplementare 1: Neutrofili transgenici nella testa di una larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sinistra) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (destra) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 5 fps. Barra della scala = 20 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Film supplementare 2: Neutrofili in Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sinistra) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (destra) larve transgeniche che rispondono alle ferite delle pinne. Il film inizia entro 10 minuti dopo il ferimento e dura 60 minuti sfGFP (verde), tagRFP (magenta). L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 10 fps. CHT = tessuto ematopoietico caudale. VF = pinna ventrale. Barra della scala = 25 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Film supplementare 3. Ulteriori esempi di neutrofili da una larva transgenica Tg (lyz: Cxcr1- FT) ferita (larva diversa da quella mostrata nel Video 2), acquisita a una risoluzione più elevata, che mostra l'internalizzazione del recettore (canale sfGFP mostrato in verde) alla mobilizzazione nel CHT o all'ingresso e chemiotassi nella pinna ventrale. L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 2 fps. Barra della scala = 10 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
File supplementare 1<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">: Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">: Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Qui descriviamo i protocolli per eseguire l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori chemioattrattari nei neutrofili zebrafish

Imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

I neutrofili sono importanti cellule infiammatorie che si infiltrano nelle ferite in risposta a ligandi chimici prodotti localmente. Questo protocollo consente la visualizzazione della dinamica dei recettori in risposta a tali ligandi in vivo. L'uso di reporter del recettore delle chemochine potrebbe essere esteso ad altri contesti fisiologici, come modelli di infezione e tumore e ad altre cellule immunitarie.Il metodo consente di tracciare quando e dove nei tessuti i leucociti percepiscono molecole chemio-attrattive. Ciò può consentire una migliore comprensione di come si sviluppano e si risolvono le risposte immunitarie. L'esecuzione di una ferita della pinna ventrale nelle larve di zebrafish richiede la manipolazione delle larve fini, quindi è necessaria un po' di pratica su larve non destinate a scopi sperimentali.Dal giorno 2,5 al 3,5 dopo la fecondazione, posizionare le larve di zebrafish anestetizzate sotto un cannocchiale da dissezione fluorescente e selezionare le larve con espressione del recettore transgenico. Trasferire le larve selezionate in una capsula di Petri da 120 millimetri contenente Tricaina integrata con terreno E3 e utilizzare un bisturi sterile per tagliare la pinna ventrale di ciascuna larva abbastanza profonda da causare un sostanziale reclutamento di neutrofili senza tagliare i vasi del tessuto ematopoietico caudale. Aggiungere 500 microlitri di tricaina 2X in un piatto con fondo di vetro, quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di agarosio e mescolare mescolando delicatamente con la punta della pipetta.Utilizzare una pipetta per trasferire le larve di pesce zebra anestetizzato ferite nel piatto e orientare l'embrione lateralmente spingendo delicatamente verso il basso in modo che la parte caudale del pesce sia il più vicino possibile al fondo di vetro. Quando l'embrione è in posizione, lasciare raffreddare l'agarosio. Dopo 5-10 minuti, toccare delicatamente il gel con un piccolo pennello per confermare la solidificazione e aggiungere due millilitri di terreno E3 integrato con 0,2 milligrammi per millilitro di tricaina alla piastra.Visualizzare il sito della ferita utilizzando un microscopio confocale a disco rotante. Il prima possibile, dopo che l'agarosio si è solidificato, trasferire l'embrione sulla piattaforma del disco rotante per imaging confocale e utilizzare il joystick del tavolino e l'obiettivo del microscopio per localizzare il pesce. Utilizzando l'obiettivo da 30 a 40X, mettere a fuoco l'area della ferita e selezionare il campo da visualizzare intorno alla ferita.Seleziona il laser e regola il tempo di esposizione, quindi imposta un timelapse ogni 30 secondi per la durata desiderata e ottieni un'immagine in campo chiaro per documentare il campo visivo. Per quantificare l'internalizzazione del recettore dei neutrofili nel sito della ferita, aprire i set di dati di immagini nelle Fiji e utilizzare il dispositivo di scorrimento temporale per selezionare un intervallo di tempo rappresentativo di interesse per ciascun set di dati. In MATLAB, crea un nuovo script e includi funzioni per la lettura delle immagini, l'apertura e la selezione manuale dei punti di interesse.Eseguire lo script per aprire il fotogramma di interesse e fare clic sui neutrofili per l'analisi. Registrare una stima dei loro centroidi, sia nella ferita della pinna ventrale che nel tessuto ematopoietico caudale. Segmenta i neutrofili in ogni fotogramma utilizzando la tecnica dei contorni attivi e crea lo script per aggiungere il calcolo della matrice di co-occorrenza del livello di grigio per ciascun neutrofilo, incluso il calcolo del contrasto dei neutrofili in base alla matrice di co-occorrenza del livello di grigio.Aggiungere comandi per salvare separatamente i valori per i singoli neutrofili nella pinna ventrale, incluso il calcolo del valore medio di contrasto dei neutrofili da tutti i neutrofili del tessuto ematopoietico caudale. Includere la normalizzazione del valore di contrasto dei singoli neutrofili nel sito della ferita al contrasto medio calcolato dei neutrofili del tessuto ematopoietico caudale per ottenere un contrasto normalizzato che rifletta quanto sia punteggiato l'aspetto di un recettore all'interno delle singole cellule che rispondono rispetto alle cellule di controllo che non rispondono. Quindi fare clic su Esegui per eseguire lo script.L'avvolgimento della pinna ventrale è seguito da una rapida mobilizzazione dei neutrofili dal tessuto ematopoietico caudale nella pinna ventrale e da un raggruppamento al margine della ferita entro 30-60 minuti dall'induzione della lesione. In questa analisi, i recettori delle chemochine CXCR1 e CXCR2 espressi dai neutrofili di zebrafish sono stati ripresi mediante microscopia confocale a disco rotante. Il modello di distribuzione dei recettori è stato quantificato utilizzando la metrica del contrasto, che riporta le differenze di intensità tra i pixel vicini.Un metodo alternativo consiste nel quantificare il rapporto tra i livelli dei recettori e i livelli di un marcatore di membrana controllato. Utilizzando la metrica di contrasto per rilevare l'internalizzazione del recettore nei cluster di neutrofili sulla ferita, è possibile quantificare le differenze visibili tra il traffico di neutrofili CXCR1 e CXCR2 nel sito della ferita. Ad esempio, in questa analisi, l'internalizzazione di CXCR1 marcata in fluorescenza nelle cellule situate nel sito della ferita è aumentata nel tempo, mentre CXCR2 marcata in fluorescenza è rimasta sulle membrane dei neutrofili nella ferita.La soppressione dei ligandi CXCR1 e CXCR2 attraverso il trattamento con morfolino provoca l'internalizzazione differenziale di CXCR1 marcata in fluorescenza nel sito della ferita. Inoltre, negli embrioni precoci, CXCR1 marcatamente marcatamente marcatamente internalizzato negli embrioni in cui il ligando del recettore è co-espresso. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'imaging deve essere eseguito il più rapidamente possibile dopo la ferita per catturare la dinamica del recettore durante il reclutamento dei neutrofili nelle ferite.Dopo l'imaging dei recettori delle chemochine in larve normali, i ricercatori possono eseguire l'imaging comparativo in larve mutanti con infiammazione disregolata.

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Tracciamento dei leucociti basato sulla fotoconversione in zebrafish transgenico infetto da batteri

Il video mostra una tecnica di ferimento e intrappolamento del pesce zebra per osservare l'infezione da patogeni fungini marcati in modo fluorescente nelle larve di pesce zebra. L'infezione iniziale attira i macrofagi e, man mano che l'infezione persiste, il reclutamento dei neutrofili progredisce nel sito di iniezione.

Una tecnica zWEDGI per visualizzare le larve di pesce zebra infettate da agenti patogeni fungini

Studiando i primi eventi di progressione delle cellule preneoplastiche e interazione innata cellule immunitarie è fondamentale per comprendere e curare il cancro. Qui si descrive un metodo per indurre condizionale trasformazioni cellule epiteliali e la successiva di immagini dal vivo di interazione innata cellule immunitarie con HRAS G12V esprimono le cellule della pelle in larve di zebrafish.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione e l'imaging di un'infezione batterica localizzata nella vescicola otica del pesce zebra.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

Vengono dimostrati modelli di infezione sistemica e localizzata da zebrafish per il virus dell'influenza umana A. Utilizzando un modello di infezione sistemica, il pesce zebra può essere utilizzato per lo screening di farmaci antivirali. Utilizzando un modello di infezione localizzata, il pesce zebra può essere utilizzato per caratterizzare le risposte delle cellule immunitarie dell'ospite.

Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Qui presentiamo un protocollo per la riparazione della ferita di vivere-imaging e la risposta infiammatoria associata al alta risoluzione spazio-temporale in vivo. Questo metodo utilizza la fase pupal dello sviluppo della drosofila per consentire a lungo termine di imaging e di monitoraggio delle popolazioni di cellule specifiche nel tempo ed è compatibile con inattivazione del gene di RNAi-mediata efficiente.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

Per testare l'effetto di una chemiochina sul reclutamento di macrofagi in vivo, l'intero montaggio in situ ibridazione è stato utilizzato per rilevare l'espressione ectopica della chemiochina, e l'immunostainizzazione è stata utilizzata per etichettare i macrofagi. L'imaging dal vivo è stato utilizzato per l'osservazione in tempo reale della migrazione dei macrofafi.

Un modello di espressione della chemiochina ectopica per testare il reclutamento macrofrofo in vivo

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) è un metodo basato sulla biologia chimica per lo studio della segnalazione reattiva di piccole molecole. Questa tecnica può essere applicata a pesci vivi di diversi stadi di sviluppo. Qui, abbiniamo saggi standard nel pesce zebra con Z-REX per l'analisi del percorso di segnalazione.

Monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - Z-REX smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti

Scopri l'imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili di zebrafish durante le risposte alle ferite. Questo metodo consente di visualizzare la dinamica dei recettori CXCR1 e CXCR2 in vivo.

Imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite

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