Name: Messa in funzione del radiatore e dosimetria per la valutazione dei parametri di α e β LQ, schema di dosamento delle radiazioni e deposizione della dose in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Scopri la calibrazione dosimetrica per esperimenti di radioterapia preclinica utilizzando camere a ionizzazione e film radiocromici. Questo metodo collega le condizioni sperimentali agli standard nazionali di dose per risultati riproducibili.

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Gli autori ringraziano le strutture di imaging per microscopio e modelli animali di WVU per l'uso delle loro apparecchiature supportate dal numero di sovvenzione P20GM103434. Inoltre, questo lavoro è stato supportato dal numero di sovvenzione P20GM121322 dall'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali, dal numero di sovvenzione del National Cancer Institute F99CA25376801 e dal Mylan Chair Endowment Fund.

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</ol>

Gli autori non hanno alcuna divulgazione da fare.

Il protocollo di cui sopra descrive un approccio di facile utilizzo per la dosimetria delle radiazioni, la determinazione dei valori di α/β nelle linee cellulari tumorali e un breve esempio di approccio per l'irradiazione in un modello preclinico di metastasi cerebrale del cancro al seno. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare qualsiasi modello di cancro e non si limitano solo alla metastasi cerebrale del cancro al seno. In questa sezione discuteremo le complessità pertinenti alla base degli esperimenti di radioterapia preclinica.
La dosimetria si comporta in due parti: 1) calibrare l'uscita con una camera dell'agricoltore, in modo da stabilire l'intensità di dose dell'unità a raggi X, e 2) preparare un pratico sistema di misurazione dosimetrica utilizzando pellicola radiocromatica. Per quanto riguarda la calibrazione dell'uscita, TG-61 fornisce un metodo riproducibile in acqua. Il protocollo qui utilizza l'acqua solida Gammex RMI 457, come raccomandato da XStrahl, il produttore dell'irradiatore. Sebbene l'analisi della dosimetria relativa (profili o curve di dose di profondità normalizzate alla dose massima) con acqua solida, accetti di essere migliore dell'1% con quella dell'acqua, vi è una differenza di circa il 3-4% in dose assoluta a causa di un coefficiente di assorbimento di energia di massa più elevato per l'acqua solida rispetto all'acqua. Tuttavia, poiché tutte le installazioni del sistema XStrahl utilizzano il protocollo dell'acqua solida per la calibrazione dell'uscita, non abbiamo corretto queste differenze. Conoscere l'uscita consente di calcolo del tempo di esposizione necessario per esegnire la dose desiderata. Posizionare il film nella stessa configurazione della camera dell'agricoltore ci consente di fornire dosi note al film. La scansione della pellicola fornisce quindi densità ottiche. La dose alla pellicola può quindi essere grata rispetto alla corrispondente densità ottica netta (differenza nella densità ottica dopo e prima dell'esposizione). Questo produce una curva di calibrazione della pellicola. Quando cambiamo le configurazioni sperimentali, l'intensità di dose in quella situazione potrebbe cambiare, poiché l'intensità di dose dipende dalle dimensioni, dalla profondità e dal materiale irradiato. Esporre la pellicola con la configurazione sperimentale ci fornisce una densità ottica netta e, utilizzando la curva di calibrazione della pellicola, possiamo quindi determinare la dose corrispondente. Dividendo questa dose per il momento in cui il film è stato irradiato, otteniamo l'intensità di dose. Questa dose può quindi essere utilizzata per calcolare il tempo di esposizione per fornire una dose desiderata per la data configurazione sperimentale. Il protocollo sopra descritto gestisce diverse sfumature associate alla dosimetria del film. Ad esempio, dopo l'esposizione, il film richiede circa 24 ore perché le reazioni chimiche nello strato attivo del film siano virtualmente complete. Non aspettare questa quantità di tempo porterà a una minore densità ottica.
Affinché ogni studio abbia dosimetria riproducibile, è importante conoscere e comprendere molti degli elementi chiave di un dato irradiatore. In particolare, è fondamentale conoscere e precisare ad altri ricercatori la fabbricazione e il modello dell'irradiatore utilizzato, il tipo di sorgente (raggi X, radioattivi, ecc.), l'energia, lo strato di mezzo valore, le dimensioni del campo, la fonte alla superficie e alla sorgente alle distanze isocentriche, le dimensioni del materiale irradiato, l'attenuazione prima e il backscatter dopo il materiale irradiato, la dose specifica dell'esperimento, lo schema di frazionamento, le apparecchiature dosimetriche esatte utilizzate e il protocollo dosimetrico utilizzato. Tutti questi punti di informazione sono ciò che descrive in modo coeso la qualità del fascio di un determinato irradiatore prima di fornire una dose a qualsiasi animale ocella 19. Un altro punto pertinente di informazione di questo protocollo e di altri è che l'intensità di dose raggiunta nel protocollo n. 1 è semplicemente la produzione dell'irradiatore utilizzato. Per ogni esperimento è importante definire l'intensità di dose per quella particolare impostazione (protocollo 4) rispetto ad una curva di taratura del film radiocromatico generata (protocollo 2).
La sperimentazione in vitro fornisce dettagli importanti sul comportamento radiobiologico delle linee cellulari tumorali. I test di sopravvivenza delle cellule clonogeniche in vitro stimano e quantificano accuratamente la radiofisività intrinseca di unalinea cellulare 20,favorendo la progettazione di programmi di frazionamento nei successivi esperimenti cellulari o su piccoli animali21. In particolare, questi saggi approssimano i valori per i parametri α e β che sono usati nel modello lineare-quadratico per prevedere la morte cellulare in risposta alla radioterapia secondo l'equazione:
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61692/61692equ09.jpg"> (Equazione 9)
dove SF è la frazione sopravvissuta delle cellule clonogenicamente vitali, D è la dose di radiazioni in Gy e α e β sono parametrimontati 22. Il rapporto α/β fornisce una misura intrinseca della radio-sensibilità cellulare, con valori più elevati correlati con una maggiore sensibilità di una lineacellulare 22. Poiché questa relazione funzionale non è lineare rispetto alla dose, gli effetti biologici di uno schema di frazionamento della radioterapia non sono solo correlati alla dose totale erogata, ma anche al numero e alla dimensione delle frazioni23. La dose biologica efficace (BED) è una misura della dose biologica vera somministrata a un tessuto e consente il confronto diretto di diversi schemi di frazionamento24,25. L'equazione BED richiede solo una stima α/β, ed è visualizzata di seguito:
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61692/61692equ14.jpg"> (Equazione 14)
dove n è il numero di frazioni della dose D. I test di sopravvivenza delle cellule clonogeniche stimano α/β e facilitano il confronto diretto degli schemi di frazionamento della radioterapia attraverso l'equazione BED. Si possono trarre conclusioni errate in merito a una risposta di tessuti o organi alla radioterapia (o combinazioni di radioterapia con altre modalità) se il LETTO nei gruppi di trattamento non è equo all'interno o tra gli esperimenti. Ad esempio, 2 frazioni di 10 Gy rispetto a 4 frazioni di 5 Gy non producono lo stesso LETTO, e quindi questi schemi di dosing non possono essere confrontati direttamente in termini di risposta biologica. L'equazione BED, sebbene imperfetta a causa dei limiti intrinseci nel modello lineare-quadratico, stima in modo affidabile effetti equi per un'ampia gamma di condizionidi trattamento sperimentale 24,25.
I test di sopravvivenza delle cellule clonogeniche svolgono chiaramente un ruolo importante nello studio degli effetti della radioterapia nei modelli di cancro, ma la sperimentazione in vitro offre una serie di opzioni aggiuntive per esplorare ulteriormente i dettagli meccanicistici della radiobiologia delle cellule tumorali. Semplici modifiche del saggio di sopravvivenza delle cellule clonogeniche sono state utilizzate per determinare le modalità di azione per alcune chemioterapie radio-sensibilizzanti, come il paclitaxel o l'etoposide26,27. Ulteriori opzioni sperimentali in vitro includono studi di immunocitochimica per esaminare specifiche vie di riparazione cellulare, come i focolai di γ-H2AX e / o la colorazione 53BP1 per la riparazione della rottura del DNA a doppiofilamento 28. Questi esperimenti possono essere di particolare interesse quando si confronta la radioterapia come una singola modalità con terapie combinato, specialmente quando si sondano dettagli meccanicistici per una data linea cellulare. Altre opzioni sperimentali includono misurazioni della citochina per esaminare il ruolo innato della risposta infiammatoria di una cellula all'irradiazione o analisi del modo di morte cellulare (ad esempio, apoptosi, necrosi, catastrofe mitotica, ecc.) in diverse condizioni terapeutiche29,30,31. Questo tipo di sperimentazione può integrare o sostituire la sperimentazione animale e fornire una comprensione più completa della radiobiologia di una linea di cellule tumorali. Indipendentemente dalla scelta di ulteriori esperimenti da condurre, un saggio standard di sopravvivenza delle cellule clonogeniche come descritto nel protocollo 3 è un'importante valutazione radiologica iniziale di una linea cellulare.
I test clonogenici e la dosimetria delle radiazioni forniscono al ricercatore un mezzo per pianificare con precisione gli esperimenti per assomigliare più direttamente agli scenari clinici. Con l'aggiunta del cancro preclinico piccoli modelli di roditori, è possibile studiare la risposta alle sole radiazioni o nel contesto di un piano di trattamento in vivo. Prima di utilizzare gli animali, è importante determinare l'uscita relativa della dose dell'impostazione specifica se differisce dall'impostazione utilizzata per la determinazione dell'uscita della dose32,33. Quando si tratta di determinare un'intensità di dose per le dimensioni del campo di &lt;10 mm, l'uso di una camera di ionizzazione diventa meno accurato a causa dell'allineamento all'interno di un piccolo campo e degli effetti di media del volumeparziale 33. L'uso di pellicola radiocromatica per determinare la produzione in combinazione con esperimenti immunoistochimici in vivo è stato utilizzato per determinare la deposizione di uscita e dose negliultimi 16,34,35,36,37,38.

I tumori rappresentano collettivamente la seconda causa di morte negli Stati Uniti e in molti paesi in tutto il mondo1. La radioterapia è una pietra miliare del trattamento per molti sottotipi tumorali e viene somministrata a circa la metà di tutti ipazienti oncologici 2,3. Gli esiti dei pazienti per quasi tutti i tumori sono migliorati nel tempo poiché le apparecchiature utilizzate per esegnare dosi di radiazioni sono costantemente avanzate e sono stati sviluppati alcuni approcci efficaci di terapia multimodale4,5,6, ma i tassi di recidiva e mortalità per i pazienti con determinati tipi di tumori rimangono alti7,8,9. Pertanto, la radioterapia per il cancro continua ad essere un'area attiva della ricerca di base e clinica. Molti studi preclitici di radioterapia utilizzano l'uso di irradiatori su piccola scala per fornire dosi di radiazioni a modelli di cancro in vitro o animali. Con una moltitudine di potenziali esperimenti per condurre l'esplorazione di dettagli di radiobiologia meccanicistica o nuovi trattamenti, possono verificarsi insidie comuni che portano a conclusioni errate, scarsa riproducibilità e risorse sprecate. Queste insidie si suddividono in tre aree importanti: dosimetria irradiatore, caratterizzazione in vitro di linee cellulari modello e programma e impostazione del dosatore di irradiazione in vivo. Risultati accurati e riproducibili di esperimenti più avanzati sono difficili da ottenere senza previa attenzione a questi aspetti fondamentali della ricerca radioterapica.
Il protocollo qui descritto descrive una strategia generalizzata per evitare o mitigare questi problemi e attinge a diverse metodologie precedentemente sviluppate destinate all'uso indipendente. Questi metodi distinti sono stati fusi in modo che un ricercatore interessato ad iniziare o migliorare gli esperimenti di radioterapia preclinica potesse usarlo come un robusto layout sperimentale. Il quadro suggerito comprende una metodologia per la messa in commissione di irradiatori animali su piccola scala, per determinare le proprietà radiobiologiche di base delle linee cellulari del cancro modello e per progettare e somministrare in modo appropriato un programma di dosamento e frazionamento per i modelli tumorali in vivo.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico, glaciale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Questo o prodotti analoghi a base di acido acetico glaciale sono accettabili.</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td>Questo o prodotti di cristallo violetto comparabili sono accettabili.</td></tr><tr><td>Baraometro digitale</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-650-118</td><td>Per misure di pressione e temperatura.</td></tr><tr><td>Elettrometro</td><td>Standard Imaging</td><td>CDX 2000B</td><td>calibrato da un ADCL; Fattore di correzione della necessità, Pelec</td></tr><tr><td>Film</td><td>Gafchromic</td><td>EBT3</td><td>Film Viene fornito in fogli da 25; i film di calibrazione e i film sperimentali devono provenire dallo stesso set</td></tr><tr><td>Camera di ionizzazione</td><td>Farmer</td><td>PTW TN30013</td><td>Calibrato da un ADCL @ due punti di calibrazione</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Questo o prodotti a base di metanolo comparabili sono accettabili.</td></tr><tr><td>Scanner fotografico</td><td>Epson</td><td>Perfection V700</td><td>Gli scanner equivalenti sono V800, V10000, V11000, V12000</td></tr><tr><td>XenX</td><td>Xstrahl</td><td>NA</td><td>Irradiator utilizzati.</td></tr></tbody></table>

messa in funzione del radiatore e dosimetria per la valutazione dei parametri di α e β lq, schema di dosamento delle radiazioni e deposizione della dose in vivo

Irradiator Commissioning and Dosimetry for Assessment of LQ &alpha; and &beta; Parameters, Radiation Dosing Schema, and in vivo Dose Deposition

La dosimetria delle radiazioni è fondamentale per l'accurata erogazione e riproducibilità degli schemi di radiazione nei modelli preclinici per un'elevata rilevanza traslizionale. Prima di effettuare esperimenti in vitro o in vivo, deve essere valutata la produzione di dose specifica per l'irradiatore e i singoli progetti sperimentali. Utilizzando una camera di ionizzazione, un elettrometro e una configurazione dell'acqua solida, è possibile determinare l'uscita della dose di ampi campi all'isocentro. Utilizzando una configurazione simile con pellicole radiocromache al posto della camera di ionizzazione, è anche possibile determinare le intensità di dose per campi più piccoli a diverse profondità. I test di sopravvivenza clonogenici in vitro delle cellule tumorali in risposta al trattamento con radiazioni sono esperimenti economici che forniscono una misura della radio-sensibilità intrinseca delle linee cellulari adattando questi dati al tradizionale modello lineare-quadratico. I parametri del modello stimati da questi saggi, combinati con i principi delle dosi biologiche efficaci, consentono di sviluppare programmi di frazionamento variabili per il trattamento con radiazioni che forniscono dosi efficaci equivalenti negli esperimenti sugli animali portanti di tumore. Questo è un fattore importante da considerare e correggere nel confrontare i programmi di radioterapia in vivo per eliminare la potenziale confusione dei risultati dovuta alla varianza nelle dosi efficaci erogata. Nel complesso, questo articolo fornisce un metodo generale per la verifica dell'emissione di dosi irradiatori preclinici per animali e armadi, la valutazione in vitro della radiofisi sensibilità e la verifica dell'emissione di radiazioni in piccoli organismi viventi.

In seguito al protocollo 1, l'intensità di dose in Gy/min è specifica dell'irradiatore utilizzato. Tuttavia, indipendentemente dal tipo di irradiatore, con un'intensità di dose nota è possibile generare una curva di taratura utilizzando il protocollo 2 che produce pellicole simili e una curva di taratura simile a quella della figura 2A-B. Un saggio di successo del protocollo 3 produrrà colonie distinte e ben delimitate di cellule che macchiano omogeneamente viola. La stima del α/β può essere confrontata con valori di letteratura o altri gruppi di trattamento per interpretare la radio-sensibilità della linea cellulare data. Utilizzando la curva di calibrazione sviluppata in seguito al protocollo 2 e visualizzata nella figura 2B, il protocollo 4 produrrà due campioni di pellicola simili alla figura 2A che possono essere utilizzati per stimare i tempi di irradiazione sperimentale richiesti. Se per l'irradiatore utilizzato è disponibile una telecamera di imaging a portale di bordo, è possibile ottenere radiogrammi di piccoli animali con e senza collimazione. La sovrapposizione di queste immagini dimostrerà l'esatto posizionamento del fascio di radiazioni collimato rispetto al piccolo animale trattato come descritto nella figura 4A. Una deposizione di dose riuscita nel protocollo 5 può essere confermata dopo il protocollo 6. Un'indicazione che le radiazioni vengono depositate in un sistema in vivo o in vitro è attraverso l'individuazione di rotture di DNA a doppio filamento. Illustrato nella figura 4B, lo stesso mouse trattato esclusivamente attraverso l'emisfero destro nella figura 4A, dimostra la colorazione γH2AX positiva solo nell'emisfero trattato. In questa figura, i nuclei sono macchiati di DAPI per mostrare due cose; 1) il tutto è del cervello a cui è stato applicato l'anticorpo anti γH2AX durante l'analisi istologica e 2) l'emisfero non trattato del cervello rimane non macchiato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig01.jpg"> Figura 1: Configurazione approssimativa della camera di ionizzazione e del fantasma d'acqua impostato per la determinazione della produzione di dose. Il pittogramma illustra una configurazione di base che utilizza i vari componenti necessari per la dosimetria utilizzando una camera di ionizzazione e fantasmi di acqua solida all'interno dell'armadio dell'irradiatore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig02.jpg"> Figura 2: Generazione di una curva di calibrazione mediante pellicola radiocromatica. (A) Cambiamento rappresentativo del colore della pellicola radiocromatica con dose crescente. In alto a sinistra (0 cGy); in basso a destra (2000 cGy). (B) Potenziale curva di taratura della pellicola radiocromatica che confronta la densità ottica netta e la dose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig03.jpg"> Figura 3: Saggio clonogenico delle cellule tumorali. Il trattamento con radiazioni delle cellule può essere effettuato prima della placcatura in sei piastre di pozzo / piastre dipetri (A), o dopo (B). Nel pannello(C), viene visualizzata un'immagine rappresentativa di un saggio clonogenico di successo con cellule tumorali mammarie MDA-MB-231 dopo aver seguito la sezione 3 del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig04.jpg"> Figura 4: Uso di due radiogrammi sovrapposti per il posizionamento (se disponibile) e di colorazione immunoistochimica γH2AX positiva per la conferma della deposizione della dose. (A) Radiogrammi rappresentativi sovrapposti che raffigurano il posizionamento del fascio di radiazioni. (B) Risultati rappresentativi che indicano la deposizione della dose nell'emisfero destro, come dimostrato dall'aumento dell'intensità γH2AX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fattore di correzione</td>
			<td colspan="2">Spiegazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nκ</td>
			<td colspan="2">Fattore di calibrazione del kerma dell'aria</td>
		</tr>
<tr>
<td>[(μen/ρ)Waria] acqua
</td>
			<td colspan="2">Razione dei coefficienti di assorbimento di energia di massa dell'acqua nell'aria; circa 1,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pq,Cham
</td>
			<td colspan="2">Contabilità di correzione per lo stelo della camera che influisce sulla perterbazione della fluidità fotona per camera; circa 1.022</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fasena P
</td>
			<td colspan="2">Contabilità di correzione per la camera di ionizzazione di protezione della suona; valore di 1, in quanto la camera è impermeabile</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ppol
</td>
			<td colspan="2">Fattore di correzione che rappresenta la polarità; determinato nel protocollo n. 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pione
</td>
			<td colspan="2">Fattore di correzione che contabilizza la ricombinazione degli ioni; determinato nel protocollo n. 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTp
</td>
			<td colspan="2">Fattore di correzione per temerpatura e pressione il giorno dell'esperimento; determinato nel protocollo n. 1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Fattori di correzione necessari per la determinazione dell'intensità di dose nel protocollo n. 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dose</td>
			<td>N</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>12*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>15*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>20*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
* Necessario solo per dosi superiori a 10 per singoli esperimenti.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Dosi da utilizzare nella generazione della curva di taratura della pellicola radiocromatica.

La dosimetria delle radiazioni fornisce una tecnica per migliorare l'accuratezza degli esperimenti preclinici e garantire che le dosi di radiazioni erogata siano strettamente correlate ai parametri clinici. Questo protocollo descrive le misure da adottare in ogni fase durante gli esperimenti sulle radiazioni precliniche per garantire un'adeguata progettazione sperimentale.

Messa in funzione del radiatore e dosimetria per la valutazione dei parametri di α e β LQ, schema di dosamento delle radiazioni e deposizione della dose in vivo

Radiation dosimetry is critical in the accurate delivery and reproducibility of radiation schemes in preclinical models for high translational relevance. ...

Questo protocollo è una nuova combinazione di diverse metodologie dosimetriche radio biologiche e di radiazioni per garantire esperimenti di radioterapia preclinica accurati, riproducibili. Questi metodi collegano le condizioni sperimentali alle norme nazionali in materia di dose e consentono misurazioni accurate delle dosi che corrispondono alle dosi di trattamento con radiazioni. Concentrandosi sulla progettazione di esperimenti di radioterapia riproducibili, questo protocollo fornisce ai ricercatori gli strumenti e i metodi necessari per eseguire studi ad alta rilevanza traslazionale.I protocolli di calibrazione dosimetrica possono essere impegnativi per i principianti, specialmente per coloro che non hanno lo sfondo in fisica medica. Suggeriamo di consultare un fisico della radioterapia quando tenta per la prima volta questi esperimenti. Le tecniche di questo protocollo sono comuni sia ai fisici delle radiazioni che ai ricercatori biomedici.Tuttavia, alcuni di questi non sono in genere utilizzati in combinazione. Per determinare l'uscita della dose appropriata, impostare l'irradiatore in modo che dia radiazioni a un kilovoltage di picco di 220 e 13 milliarti con un campo aperto di 17 per 17 centimetri posizionato a 35 centimetri dalla sorgente. Filtrare il fascio con un filtro in rame di 0,15 millimetri con un'ampia messa a fuoco e allineare la lastra di un centimetro, la lastra di due centimetri, la lastra di due centimetri con la camera di ionizzazione e la lastra di un centimetro.Dopo aver configurato la pila fantasma, inserire la camera di ionizzazione nel fantasma e regolare le pile in modo che la sorgente alla distanza della superficie sia di 33 centimetri quando opportunamente livellata. Quindi confermare che queste misurazioni sono posizionate correttamente all'interno della camera di ionizzazione a 35 centimetri dall'isocentro. Per creare una curva di calibrazione della pellicola radiocromatica, preparare diversi pezzi di pellicola aggiuntivi delle stesse dimensioni e orientamento e posizionare il film a una profondità di due centimetri nella pila fantasma dell'acqua solida.Per iniziare l'irradiazione, posizionare un pezzo di pellicola sopra quattro centimetri di acqua solida e posizionare i restanti due centimetri di acqua solida sopra le pellicole. Dopo aver richiesto scansioni di pellicole post-esposizione, importate i file di immagine in ImageJ in un formato di file tiff e selezionate Immagine(Image), Colore (Color) e selezionate Dividi canali (Split Channels). Solo nel canale dell'immagine rossa, usate lo strumento rettangolo per disegnare un'area di interesse e premete Ctrl+M per consentire la trascrizione dei valori medi dalla finestra dei risultati.Una volta ottenuti tutti i valori dei pixel per le pellicole non esposte ed esposte, calcolare la densità ottica netta utilizzando l'equazione come indicato, quindi tracciare la densità ottica netta rispetto alla dose alla quale il film è stato esposto e adattarsi al grafico con una curva quadratica. Per determinare il valore alfa/beta per specifiche linee cellulari tumorali attraverso un saggio clonogenico, contare il numero risultante di colonie in ogni gruppo di trattamento per consentire il calcolo della frazione di sopravvivenza di ciascuna piastra, quindi tracciare il log naturale della frazione di sopravvivenza rispetto alla dose corrispondente erogata e adattarsi alla curva con una funzione quadratica. Per determinare l'uscita di dose specifica per progetti sperimentali variabili, selezionare le dimensioni e la distanza del campo desiderate dalla sorgente e utilizzare i fantasmi dell'acqua solida per fornire accumulo e backscatter in base alle esigenze, posizionando il pezzo di pellicola nell'orientamento che meglio ritrae il design sperimentale.La dose può quindi essere determinata dalla densità ottica netta del film utilizzando la curva di calibrazione del film per la dose. Per determinare la posizione del fascio appropriata per un trattamento del mouse con cuscinetto tumorale, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, utilizzare una telecamera a portale integrata e un filtro in alluminio per ottenere un radiogramma del mouse sperimentale senza collimazione, quindi ottenere un radiogramma con collimazione in posizione e sovrapporre i radiogrammi in ImageJ per determinare il posizionamento del fascio. Utilizzando la curva di calibrazione come dimostrato, è possibile generare due campioni di pellicola che possono essere utilizzati per stimare i tempi di irradiazione sperimentali richiesti.La sovrapposizione di queste immagini rivelerà l'esatto posizionamento del fascio di radiazioni collimato rispetto al piccolo animale trattato. La deposizione di dose riuscita può quindi essere confermata come illustrato dalla colorazione gamma-H2AX positiva osservata all'interno dell'emisfero trattato solo in questa analisi rappresentativa. Rimanere coerenti quando si va dalla determinazione dell'uscita dell'irradiatore alla generazione di una curva di calibrazione della pellicola e quando si determina la dose per il progetto sperimentale ideale è fondamentale.Seguire questi protocolli consente ai ricercatori di studiare un'ampia varietà di domande radiobiologiche clinicamente applicabili in un ambiente preclinico. Queste domande possono portare a una migliore comprensione dei risultati dei pazienti. Questo protocollo non è una nuova tecnica autonoma.Tuttavia, la combinazione di queste metodologie porterà a una rilevanza clinica diretta e fornirà approfondimenti sui risultati per le dosi viste in clinica.

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