Analisi del tracciamento delle nanoparticelle di nanoparticelle d'oro nei media acquosi attraverso un confronto tra laboratori

Questo protocollo utilizza l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle per eseguire misurazioni accurate, affidabili e riproducibili dei diametri idrodinamici dei nanomateriali di interesse. Il metodo è rapido e facile da eseguire, facilitando la misurazione del diametro idrodinamico sferico equivalente delle particelle, tramite l'analisi visiva in tempo reale particella per particella e la preparazione minima del campione. Prima di eseguire una misurazione, filtrare il volume di acqua ultra pura da utilizzare per l'analisi attraverso un filtro a siringa da 0,02 micron.

Diluire opportunamente il campione nell'acqua filtrata. Per questo campione di dispersione colloidale d'oro a 60 nanometri, diluire volumetricamente di un fattore di 50. Collegare lo strumento NTA, la pompa a siringa e il computer e accendere l'hardware e il software.

Rimuovere il modulo laser dal sistema e utilizzare un fazzoletto e aria compressa per asciugare completamente le superfici in vetro e i canali interni LVFC, i tubi e le porte fluidiche. Posizionare l'LVFC sul modulo laser, quindi fissarlo con le quattro viti che le serrano in diagonale. Collegare il tubo di uscita alla porta sul lato destro della cella.

Inserire il tubo di ingresso nel flacone di scarico e sciacquare 900 microlitri di soluzione detergente il più rapidamente possibile grazie alla contropressione. Sostituire la siringa collegata al tubo di ingresso con una nuova siringa contenente un millilitro di acqua filtrata e collegare il tubo di ingresso alla porta sinistra della cella di flusso. Quindi introdurre lentamente circa 500 microlitri di fluido nella camera del campione, facendo attenzione che non vengano introdotte bolle d'aria durante il caricamento.

Per caricare il modulo laser, inserire l'LVFC riempito d'acqua nello strumento e bloccare la cella in posizione. Fissare la siringa e la base della pompa della siringa e fare clic su Avvia fotocamera nell'interfaccia del software per inizializzare la fotocamera. Nella scheda hardware, fare clic su Scatter per spostare la posizione di riferimento e impostare il livello della telecamera su 16.

Regola manualmente la messa a fuoco per controllare la presenza di particelle nel diluente, quindi fai clic con il pulsante sinistro del mouse e trascina nella finestra di visualizzazione principale per regolare la posizione del campo visivo per verificare la presenza di particelle. Per pulire il sistema, sostituire la siringa con una siringa piena solo d'aria e sostituire lentamente l'acqua nella camera con aria. Rimuovere la cella dal modulo laser dallo strumento e scollegare i pezzi di tubo.

Pulire il vetro ottico del modulo laser e le superfici in vetro dell'LVFC con acqua e asciugare con un fazzoletto e aria compressa. Dopo aver riassemblato l'LVFC e il modulo laser e aver adescato il tubo, collegare una siringa contenente un millilitro della sospensione di nanoparticelle d'oro a 60 nanometri alla porta inferiore e iniettare lentamente 750 microlitri di campione nella camera LVFC. Dopo aver caricato il modulo laser e inizializzato la fotocamera, fare clic su Scatter per spostare la messa a fuoco di riferimento in posizione confermando che la messa a fuoco sia impostata correttamente per fornire un'immagine chiara delle particelle.

Verificare che il campo visivo sia impostato centralmente rispetto alla posizione del raggio laser ed eseguire la funzione di configurazione automatica per ottimizzare automaticamente la messa a fuoco e il livello della telecamera per garantire il raggiungimento di una qualità dell'immagine ottimale. Per analizzare il campione, aprire la scheda Procedura operativa standard di misurazione standard e impostare lo strumento per acquisire cinque video di 60 secondi a flusso lento e costante. Impostare quindi il nome del file e il percorso dei dati e avviare l'esecuzione.

Per analizzare i dati, trascinare la barra di scorrimento nella scheda Soglia di rilevamento per impostare la soglia di rilevamento in modo che venga rilevato e tracciato il maggior numero possibile di particelle visibili. Assicurarsi che non si osservino più di cinque croci blu indicanti il rumore. Per elaborare automaticamente i video di analisi del tracciamento delle particelle, fare clic su Impostazioni, OK e lasciare tutti i parametri di elaborazione sulle impostazioni automatiche.

Al termine dell'elaborazione dei dati, esportare i dati come file dei risultati del modulo CSV. Qui, vengono mostrati i risultati del confronto interlaboratorio del primo round ottenuti utilizzando varie configurazioni di strumenti di analisi per il tracciamento delle nanoparticelle. Con l'eccezione del laboratorio sei, la ripetibilità tra le cinque ripetizioni di acquisizione è stata buona, anche se diversi laboratori hanno registrato una dimensione della modalità superiore al previsto.

L'accuratezza dei risultati dell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle del terzo round è stata migliorata da tutti i laboratori che implementano la stessa procedura operativa standard e le impostazioni dello strumento con una modalità media in tutti i laboratori di 62,02 più o meno 1,97 nanometri. Il diametro medio delle particelle può essere calcolato utilizzando immagini di microscopia elettronica a trasmissione come tecnica complementare all'NTA per convalidare la dimensione, la morfologia e il rapporto d'aspetto delle particelle. In questa analisi, le particelle sembrano essere per lo più sferiche con un rapporto d'aspetto medio di 1,1.

È importante assicurarsi che la cella a flusso a basso volume sia ben pulita prima dell'uso, che il campione sia adeguatamente diluito, ben caricato e focalizzato e che la SOP sia seguita. Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi altra caratterizzazione di nanoparticelle, inclusi esosomi e virus per supportare studi di stabilità e processi di qualità controllata.