Name: Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Scopri le proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale NICO-1. Questo modello riproducibile facilita lo studio dell'iniziazione tumorale e della resistenza terapeutica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un Grant-in-Aid for Scientific Research C (grant no. 19K09834 to K.N.) del Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Cultura, Giappone.

Tutte le procedure sono state eseguite secondo il protocollo approvato dal Comitato etico per il benessere umano. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto per l'uso della ricerca dei loro campioni e la raccolta e l'uso dei tessuti per questo studio sono stati approvati dal Comitato etico per la ricerca sul genoma umano, analisi genica dell'Università di Teikyo.
1. Isolamento e coltura di cellule staminali tumorali ovariche (OCSC) da pazienti con carcinoma ovarico e ascite in un armadio di biosicurezza di livello 2
<ol><li>Isolare le cellule staminali tumorali dall'ascite del cancro ovarico umano ottenuta tramite paracentesi. Raccogliere almeno 100-250 ml di ascite dai pazienti per assumere un numero sufficiente di cellule staminali tumorali. Inoltre, valutare i profili di espressione dei marcatori delle cellule staminali tumorali (cioè EpCAM, Calretinina, CD133, CD44, CD45, ALDH1 e Oct4) e dei marcatori del cancro ovarico (pAX-8, WT-1) mediante citometria a flusso.<ol><li>Centrifugare l'ascite del cancro ovarico umano a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente entro 24 ore dopo l'aspirazione dell'ascite.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e aggiungere 2 mL di terreno OCSC e 8 mL di soluzione salina tamponata Histodenz/fosfato al 30% (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Preparare il terreno OCSC: integratore StemPro hESC, DMEM⁄F-12 con L-glutammina (mezzo GlutaMAX), 25% BSA, 100 μM 2-mercaptoetanolo, 8 ng/mL FGF BASICO, 10 μM insulina e 20 μM Y-27632.</li>
		<li>Sovrapporre accuratamente 2 mL di terreno OCSC alla soluzione cellulare al punto 1.1.2 in una provetta da 15 mL e centrifugare a 450 x g per 20 minuti a temperatura ambiente in un rotore a benna oscillante senza frenare.</li>
		<li>Trasferire con cautela lo strato OCSC (indisturbato all'interfase) in un nuovo tubo da 15 mL mediante pipetta di trasferimento.</li>
		<li>Riempire con PBS fino a 15 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in terreno OCSC e seme su un piatto di coltura a bassissimo attacco; le colture devono essere mantenute a 37 °C in 5% di CO2.</li>
		<li>Cambia il mezzo ogni tre giorni. Tenere attentamente il piatto di coltura per circa 1 minuto, scartare parte del surnatante e aggiungere il nuovo mezzo.</li>
	</ol></li>
	<li>Passaggio dei CSC<ol><li>Raccogliere gli OCSC in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante, riempire con PBS e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL della soluzione di distacco cellulare costituita da enzimi proteolitici e collagenolitici (ad es. AccuMax) e incubare a 37 °C per 10 minuti.</li>
		<li>Mescolare bene mediante pipettaggio e incubare a 37 °C per 5 minuti. Assicurarsi che le celle siano in un'unica sospensione.</li>
		<li>Mescolare bene mediante pipettaggio, riempire con PBS e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo OCSC per la successiva semina su piastre di coltura a bassissimo attacco e il mantenimento a 37 °C in CO 2 al 5%.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coltura cellulare endoteliale HUEhT-1
<ol><li>Passaggio delle cellule HUEhT-1<ol><li>Rimuovere il terreno dal piatto di coltura HUEhT-1 e lavare le cellule con PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,025% e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 5 ml di Endothelial Cell Growth Medium 2, raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in mezzo HUEhT-1 e seminare le cellule su piatti di coltura rivestiti di collagene seguiti dal mantenimento a 37 °C in CO 2 al 5%.</li>
		<li>Cambia il mezzo ogni tre giorni.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparazione della piastra di cocoltura NICO-1 per il saggio di formazione del tubo utilizzando cellule HUEhT-1
<ol><li>Assemblare NICO-1 e rivestirlo con l'idrogel a base di matrice extracellulare (Matrigel Matrix).<ol><li>Assemblare un lato di NICO-1 seguendo le istruzioni del produttore e conservare in ghiaccio.</li>
		<li>Coprire la superficie di NICO-1 con 300 μL di PBS freddo e quindi rimuovere il tampone.</li>
		<li>Aggiungere 300 μL di idrogel refrigerato a base di matrice extracellulare e incubare a 37 °C per 60 minuti.</li>
		<li>Per equilibrare, immergere il filtro con etanolo al 100%, quindi lavare un filtro ICCP da 13 mm (0,6 μm) con PBS per 1 minuto.</li>
		<li>Assemblare il NICO-1 includendo entrambe le parti principali del corpo A (camera destra) e B (camera sinistra) insieme all'O ring e al filtro equilibrato.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Semina di cellule HUEhT-1 e CSC sul sistema NICO-1
<ol><li>Preparare sospensioni cellulari HUEhT-1 tripsinizzando i monostrati cellulari e risospendendo le cellule nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali con siero fetale di vitello al 2%.</li>
	<li>Aggiungere 1,2 ml di sospensione cellulare (1,5 x 105 celle) a ciascun pozzetto rivestito di idrogel a base di matrice extracellulare.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 ml di OCSC coltivati per cinque giorni all'altro pozzetto.</li>
	<li>Incubare NICO-1 a 37 °C in 5% di CO2; La formazione del tubo può essere osservata al microscopio e la formazione della rete su idrogel a base di matrice extracellulare misurata per mezzo del numero di rami.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%2C+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+fate+in+cancer+growth%2C+progression+and+therapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%2FActivin+signaling+drives+selfrenewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>Ohata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+stem-like+cell+regulator+CD44+by+Rho+kinase+inhibition+contributes+to+the+maintenance+of+colon+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+in+vitro+model+of+ovarian+cancer+stem-like+cells+with+an+enhanced+proliferative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity.</a> Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Zong, X., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+role+in+metastasis+and+opportunity+for+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).</li>
<li>Lizárraga-Verdugo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+its+role+in+angiogenesis+and+vasculogenic+mimicry+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers.</a> Frontiers in oncology. 10, 413(2020).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Richardson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell-mediated+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation.</a> Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).</li>
<li>Plotnikov, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+IFN-gamma+in+priming+MSC-mediated+suppression+of+T+cell+proliferation+through+up-regulation+of+B7-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1.</a> Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).</li>
<li>Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+canine+mesenchymal+stem+cells+with+primary+bone-derived+osteoblasts+promotes+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell%2Fmesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li>
<li>Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+from+the+retropatellar+fat+pad+and+peripheral+blood+stimulate+ACL+fibroblast+migration%2C+proliferation%2C+and+collagen+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression.</a> Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+%26+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).</li>
<li>Burger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+bevacizumab+in+the+primary+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).</li>
<li>Goel, H., Mercurio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+targets+the+tumour+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">VEGF targets the tumour cell.</a> Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bevacizumab+and+murine+VEGF-A%3A+a+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato descrive come imitare il microambiente tumorale degli OCSC in un ambiente in vitro. La componente principale del metodo è costituita dal modello di cocoltura altamente riproducibile ottenuto utilizzando il sistema NICO-1, un sistema di co-coltura Transwell indiretto. Molti dei modelli di cocoltura attualmente disponibili esaminano gli effetti del contatto diretto cellula-cellula sulle popolazioni cellulari di cocoltura 12,13,14,15,16,17,18.</su...

Il cancro ovarico è l'ottavo tumore maligno più comune nelle donne in tutto il mondo, con circa 300.000 nuove diagnosi e circa 180.000 decessi all'anno1. Alla diagnosi iniziale, il carcinoma ovarico si presenta spesso con sintomi gravi, con circa il 75% delle pazienti già allo stadio III-IV. Di conseguenza, il tasso di sopravvivenza a 5 anni è del <30% e il tasso di mortalità è il più alto tra i tumori ginecologici2, con l'efficacia del trattamento per il cancro ovarico che dipende fortemente da fattori clinici come il successo della chirurgia di debulking, la resistenza alla chemioterapia e la recidiva dopo la terapia iniziale.
I tessuti del cancro ovarico sono organizzati gerarchicamente, con non tutti i componenti tumorali ugualmente in grado di generare discendenti. Le uniche cellule in grado di auto-rinnovarsi e produrre una popolazione eterogenea di cellule tumorali sono considerate cellule staminali tumorali (CSCs)3. L'auto-rinnovamento delle CSC e l'iniziazione del tumore sono accompagnati dalla promozione dell'angiogenesi per rimodellare il loro microambiente tumorale allo scopo di mantenere una nicchia di supporto. Tuttavia, i modelli precedenti non potevano essere utilizzati per le analisi in vitro a causa della limitata riproducibilità della coltivazione di CSCs derivate da campioni clinici a causa della rottura degli sferoidi dopo passaggi multipli. Più recentemente, sono stati sviluppati metodi sperimentali per coltivare CSC da pazienti per diverse applicazioni 4,5,6,7. In particolare, sfruttando la caratteristica delle CSCs di crescere formando sferoidi in piastre di attacco ultra-basse con mezzo privo di siero, le CSCs coltivate sono indotte ad esprimere un marcatore di superficie staminale che non è espresso in cellule tumorali normali con potenziale di differenziazione multilineage 8,9.
Dati recenti hanno dimostrato che la persistenza di (O)CSCs ovariche dormienti visualizzate come disseminazione al peritoneo è associata alla loro rigenerazione come tumori ricorrenti10. La comprensione delle caratteristiche molecolari e biologiche degli OCSC può quindi consentire un efficace targeting ed eradicazione di queste cellule, con conseguente potenziale remissione del tumore. In particolare, poco si sa riguardo alle caratteristiche meccanicistiche cellulari e molecolari dei ruoli delle CSCs nell'angiogenesi11. Pertanto, nel presente protocollo abbiamo utilizzato OCSC derivati dal paziente in un setting in vitro per studiare la proprietà angiogenica delle cellule endoteliali utilizzando il modello di co-coltura, che può imitare il microambiente tumorale delle CSCs e delle cellule endoteliali nel sito metastatico in ambito clinico. In definitiva, poiché la neovascolarizzazione costituisce un processo critico necessario per supportare la crescita tumorale e le metastasi, una migliore comprensione del suo meccanismo consentirà lo sviluppo di una nuova terapia mirata per gli OCSC nel sito metastatico.
Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare la fase di neovascolarizzazione che circonda le CSC in un modo di tempo. Il vantaggio del protocollo include la possibilità di indagini completamente riproducibili utilizzando il sistema di co-coltura 3D, NICO-1, consentendo così l'osservazione degli effetti sui pazienti della capacità di iniziazione del tumore derivata da OCSC durante l'angiogenesi delle cellule endoteliali.

<table><tbody><tr><td>0,025% tripsina&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Pipetta Thermo</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>1250 &micro; L Punta per pipetta</td><td>QSP</td><td>T112XLRS-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 mL provetta</td><td>Nunc</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Punta per pipetta</td><td>QSP</td><td>T110RS-NEW</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipet</td><td>Thermo</td><td>170366N</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>AccuMAX</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>BioCoatTM Collagene I 60mm Piatto</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>KUBOTA</td><td>2800</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 pozzetti trasparente fondo piatto attacco ultra basso</td> piastre <td>a pozzetti multipli Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali 2&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-22011&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>WAKO</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>SIGMA</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>HUEhT-1 cella</td><td>JCRB Banca di cellule</td><td>JCRB1458</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ICCP 0,6 &; m</td><td>Ginrei Lab.</td><td>2525-06</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, umano</td><td>SIGMA (Roche)</td><td>11376497001</td><td></td></tr><tr><td>Luminometro</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO MX-flad</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Yokogawa</td><td>CQ-1</td><td></td></tr><tr><td>NICO-1</td><td>Ginrei Lab.</td><td>2501-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPlate-96</td><td>PerkinElmer</td><td>6005290</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipet</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>A1000701</td><td></td></tr><tr><td>pipetta di trasferimento</td><td>FALCON</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>WAKO</td><td>253-00513</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, nico-1

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Le cellule staminali tumorali (CSC) risiedono in una nicchia di supporto, costituendo un microambiente composto da cellule stromali adiacenti, vasi e matrice extracellulare. La capacità delle CSCs di partecipare allo sviluppo dell'endotelio costituisce una caratteristica importante che contribuisce direttamente alla comprensione generale dei meccanismi della tumorigenesi e delle metastasi tumorali. Lo scopo di questo lavoro è quello di stabilire una metodologia riproducibile per studiare la capacità di inizio del tumore delle cellule staminali tumorali ovariche (OCSC). Qui, abbiamo esaminato il meccanismo di neovascolarizzazione tra cellule endoteliali e OCSC insieme ai cambiamenti morfologici delle cellule endoteliali utilizzando il modello di co-coltura in vitro NICO-1. Questo protocollo consente di visualizzare la fase di neovascolarizzazione che circonda gli OCSC in modo temporizzato. La tecnica può fornire informazioni sulle proprietà angiogenetiche degli OCSC nelle metastasi tumorali.

Abbiamo raccolto fluidi asciti ottenuti da pazienti con carcinoma ovarico avanzato durante l'intervento chirurgico o la paracentesi allo scopo di eseguire una coltura stabile a lungo termine per gli sferoidi. Qui, presentiamo casi di una coltura sferoide a lungo termine di CSCs ovariche denominate CSC1 e CSC2. Entrambe le linee cellulari portano la stessa diagnosi e gli stessi profili istologici. I ruoli meccanicistici degli OCSC alla base dell'interazione con le cellule endoteliali neces...

Le cellule staminali del cancro ovarico (OCSC) sono responsabili dell'inizio del cancro, della recidiva, della resistenza terapeutica e delle metastasi. Si ritiene che la nicchia vascolare OCSC promuova l'autorinnovamento degli OCSC, portando alla chemioresistenza. Questo protocollo fornisce la base per stabilire un modello di nicchia vascolare OCSC riproducibile in vitro.

Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Il cancro ovarico ha un alto tasso di mortalità tra le neoplasie ginecologiche. Le cellule staminali del cancro ovarico e la loro nicchia vascolare sono in grado di rimodellare il microambiente tumorale. Tuttavia, i precedenti modelli di cellule staminali di cancro ovarico non hanno consentito l'analisi dettagliata a causa della loro limitata riproducibilità.Il vantaggio del nostro protocollo include la riproducibilità del suo sistema di co-coltura 3D, che facilita lo studio degli effetti delle capacità di inizio del tumore derivate da cellule staminali del cancro ovarico nei pazienti durante l'angiogenesi. A dimostrare la procedura sarà Yuko Miyagawa, ricercatrice del nostro laboratorio. Per isolare le cellule staminali tumorali dall'ascite del carcinoma ovarico umano ottenuta tramite paracentesi, raccogliere da 100 a 250 millilitri di ascite della paziente e centrifugare il campione entro 24 ore dall'acquisizione.Risospendere i pellet in due millilitri di terreno OCSC e aggiungere otto millilitri di terreno a gradiente di densità non ionica al 30% in PBS a ciascun campione. Trasferire le sospensioni cellulari in provette individuali da 15 millilitri e sovrapporre con cura due millilitri di terreno OCSC aggiuntivo sulla soluzione cellulare in ciascuna provetta. Separare le celle mediante centrifugazione in gradiente di densità e trasferire con cura l'OCSC all'interfase in una nuova provetta da 15 millilitri.Lavare le cellule raccolte con un volume completo di PBS e risospendere i pellet in terreno OCSC fresco. Semina le cellule su piastre di coltura a bassissimo attaccamento e incuba le colture a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo cinque giorni di coltura, raccogliere le cellule in una provetta da 15 millilitri per piastra mediante centrifugazione.Dopo una seconda centrifugazione in PBS, risospendere le cellule in un millilitro di soluzione di distacco cellulare di enzimi proteolitici e collagenolitici per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, mescolare bene pipettando e riportare le cellule a 37 per altri cinque minuti. Al termine dell'incubazione, miscelare nuovamente le cellule mediante pipettaggio e riempire la provetta con PBS per il lavaggio mediante centrifugazione.Quindi, risospendere il pellet in terreno OCSC e seminare le cellule su nuovi piatti di coltura a bassissimo attacco. Per allestire una coltura di cellule endoteliali HUEhT-1, lavare le cellule HUEhT-1 con PBS e trattare le cellule con tripsina allo 0,025% per tre minuti a temperatura ambiente. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con cinque millilitri di terreno di crescita delle cellule endoteliali e raccogliere le cellule in una provetta da 15 millilitri per la centrifugazione.Quindi, risospendere il pellet in terreno HUEhT-1 a una concentrazione di 1,5 per 10 fino alla quinta concentrazione e seminare le cellule su piastre di coltura rivestite di collagene. Per impostare una piastra di co-coltura interattiva per un saggio di formazione di provette, assemblare il dispositivo NICO-1 secondo le istruzioni del produttore e posizionare il sistema sul ghiaccio. Lavare l'assemblaggio con 300 microlitri di PBS freddo prima di aggiungere 300 microlitri di idrogel a base di matrice extracellulare refrigerata al dispositivo per un'incubazione di 60 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, immergere un filtro sterile da 13 millimetri in etanolo al 100% seguito da un'immersione di un minuto in PBS. Al termine dell'incubazione, posizionare un O-ring e il filtro bilanciato nelle apposite camere del corpo dell'assemblaggio. Quando il dispositivo è stato assemblato, risospendere le cellule HUEhT-1 a 1,25 per 10 fino alla quinta cellula per millilitro di terreno di crescita delle cellule endoteliali integrato con una concentrazione sierica fetale di vitello al 2% e aggiungere 1,2 millilitri di cellule a ciascuna matrice extracellulare basata su idrogel ben rivestito.Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di OCSC coltivato per cinque giorni a un pozzetto e posizionare il sistema NICO-1 nell'incubatore per colture cellulari. La formazione del tubo può essere osservata al microscopio ottico e le reti cellulari di formazione sull'idrogel basato sulla matrice extracellulare possono essere misurate quantificando il numero di rami che si formano all'interno della co-coltura nel tempo. Qui, si può osservare un confronto dell'attività di formazione del tubo indotta da due diverse CSC.In questa analisi, il numero di tubi vascolari formati è aumentato notevolmente nel tempo durante la co-coltura con la seconda popolazione di CSC. In queste immagini, la proprietà angiogenica di HUEhT-1 dopo il trattamento con fattore di crescita dell'endotelio vascolare senza co-coltura di CSC2 può essere osservata come controllo positivo. In questo modello di co-coltura di cellule endoteliali OSCS che utilizza il sistema NICO-1, le cellule HUEhT-1 sono state co-coltivate con CSC2 per 20 ore.Come osservato tramite imaging video time lapse, le cellule HUEhT-1 hanno formato tubi vascolari nel corso della co-coltura CSC di 20 ore. Recenti scoperte hanno portato all'uso clinico di inibitori di PARP per il carcinoma ovarico, difettosi nella riparazione della ricombinazione omologa, nonché di bevacizumab anti-angiogenico. Il nostro protocollo che utilizza un sistema di co-coltura 3D può fornire informazioni sulla proprietà angiogenica delle cellule staminali del cancro ovarico nelle metastasi tumorali.

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Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1 (Video) | JoVE Journal

Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1

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