Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

Questo protocollo è il primo ad implementare CESI-MS per la caratterizzazione non solo della corona proteica, ma anche della corona dei metaboliti dei nanomateriali. CESI offre una separazione ortogonale ai metodi LCMS tradizionali, che è altamente riproducibile e sensibile utilizzando solo pochi nanolitri di campione. Per iniziare, dividere due millilitri di plasma umano in aliquote da un millilitro, una per il metabolita e la corona proteica e una per la caratterizzazione del metaboloma plasmatico.

Incubare un milligrammo per millilitro di nanomateriali nel plasma umano per un'ora a 37 gradi Celsius mescolando delicatamente a 500 rotazioni al minuto in un termomiscelatore. Quindi, pellettare i nanomateriali centrifugando a 4.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante plasmatico per l'analisi della corona del metabolita e conservare il complesso corona proteico del nanomateriale per la caratterizzazione della corona proteica.

Risospendere il pellet in un millilitro di tampone PBS 10X e agitare energicamente per due minuti per rimuovere le proteine non legate. Centrifugare la soluzione a 4.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i nanomateriali, quindi rimuovere il surnatante con cura senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone ABC e agitare energicamente per due minuti per rimuovere le proteine e i sali non legati.

Ripetere la fase di centrifugazione ed eliminare il surnatante. Sciogliere il pellet in 20 microlitri di tampone ABC contenente 10 millimolari di ditiotreitolo per ridurre i legami disolfuro proteico. Incubare la soluzione per 30 minuti a 56 gradi Celsius.

Aggiungere due microgrammi di tripsina di grado sequenziale ai 20 microlitri di tampone ABC contenente lo 0,1% di tensioattivo e incubare la soluzione digestiva a 37 gradi Celsius per 16 ore. Alchilare il campione aggiungendo 20 microlitri di iodoacetammide da 55 millimolari in ABC da 100 millimolari e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere 20 microlitri di acido cloridrico molare 0,1 per scindere il tensioattivo e lasciare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente.

Arricchire e dissalare i peptidi utilizzando un puntale per pipetta di desalinizzazione confezionato in C18 come descritto nel manoscritto del testo. Quindi liofilizzare il campione e conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi. Prelevare il plasma di controllo e il surnatante dall'incubazione del plasma nanomateriale e metterli in ghiaccio.

Aliquotare 50 microlitri da ciascun campione in fiale separate e diluire dieci volte con acqua distillata. Dopo il vortex, spostare 50 microlitri di questo campione diluito in nuove fiale. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio, 250 microlitri di metanolo e 350 microlitri di acqua distillata e agitare energicamente per due minuti.

Centrifugare a 20, 800 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Prelevare 500 microlitri di surnatante e filtrarlo attraverso un filtro centrifugo da tre kilodalton per due ore a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius. Asciugare 430 microlitri di ultra filtrato in uno speed vac e congelare il campione.

Prima dell'installazione dei capillari nello strumento CESI, verificare che le estremità di ingresso e uscita dei capillari siano intatte e che non vi siano rotture visibili nel capillare. Quindi posizionare un nuovo capillare neutro codificato nello strumento, seguendo le linee guida del produttore. Lavare il capillare di separazione in avanti con acido cloridrico 100 millimolare, quindi con BGE e infine con acqua distillata, utilizzando le condizioni descritte nel manoscritto del testo.

Quindi lavare sia il capillare di separazione che quello conduttivo con BGE, seguito da acqua distillata, acido cloridrico 100 millimolare, di nuovo acqua distillata e infine con BGE. Accoppiare CESI all'MS utilizzando la sorgente di spray nano e l'adattatore. Per l'analisi della corona proteica, risospendere i campioni liofilizzati in 20 microlitri di acetato di ammonio da 50 millimolari a pH quattro.

Eseguire l'analisi CESI-MS per i campioni come descritto nel manoscritto del testo. Raccogli dati sugli spettri di massa tra 250 e 2.000 m/z, con l'acquisizione della frammentazione dipendente dai primi 10 dati, e risciacqua il capillare tra i campioni. Posizionare un nuovo capillare di silice fusa nuda nello strumento CESI.

Lavare il capillare di separazione in avanti utilizzando metanolo al 100%, quindi lavare sia il capillare di separazione che quello conduttivo con BGE per garantire la formazione di goccioline alle estremità di uscita. Quindi sciacquare il capillare con acqua distillata, seguita da idrossido di sodio 0,1 molare, di nuovo acqua distillata e infine con BGE. Accoppiare CESI al SEMS utilizzando la sorgente di spray nano e l'adattatore.

Per eseguire l'analisi della corona dei metaboliti, risospendere i campioni di plasma nanomateriale esposti e non esposti in 430 microlitri di acqua distillata e agitare vigorosamente per due minuti. Filtrare i campioni attraverso un filtro a membrana da 0,1 micrometri. Aggiungere cinque microlitri degli standard interni, come menzionato nel manoscritto del testo, a 95 microlitri di filtrato e agitare energicamente.

Centrifugare a 16, 100 volte G e quattro gradi Celsius. Eseguire l'analisi CESI-MS per i campioni come descritto nel manoscritto del testo. L'uso di CESI-MS per la separazione e la rilevazione proteomica e metabolomica dimostra buone finestre di separazione su entrambi i capillari per ogni approccio, consentendo una caratterizzazione completa della corona biomolecolare.

Il metodo proteomico CESI-MS è in grado di distinguere tra una serie di proteine e concentrazioni proteiche nella corona attraverso un'ampia gamma di composizioni di nanomateriali e può distinguere una corona proteica unica per ogni nanomateriale. Questo approccio metabolomico CESI-MS consente un'analisi quantitativa del metabolita corona e può essere utilizzato per scoprire le sue impronte digitali uniche. Sebbene questo approccio caratterizzi passivamente la corona del metabolita del nanomateriale, è ancora in grado di scoprire interessanti intuizioni sul ruolo dei metaboliti nella corona biomolecolare, come l'assorbimento differenziale degli isomeri.

Questa tecnica consente di caratterizzare sia la proteina che il metabolita corona, consentendo una migliore comprensione di come la corona biomolecolare completa influenzi l'assorbimento dei nanomateriali da parte delle cellule.