Name: Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Scopri la caratterizzazione della corona biomolecolare completa di nanomateriali usando CESI-MS per analisi proteiche e metabolomiche. Questo metodo offre alta sensibilità e riproducibilità per studi avanzati.

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A.J.C, J.A.T e I.L riconoscono il finanziamento della Commissione Europea tramite il progetto Horizon 2020 ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z riconosce il finanziamento del dottorato di ricerca dal China Scholarship Council (CSC, No. 201507060011). R.R riconosce il sostegno finanziario del programma di sovvenzioni Vidi dell'Organizzazione olandese della ricerca scientifica (NWO Vidi 723.0160330).

L'uso di biofluidi umani è stato approvato secondo le linee guida del protocollo IRB dell'Università di Leida e dell'Università di Medicina di Innsbruck. Quando si studiano biofluidi umani o animali, è necessaria l'approvazione etica da parte dell'istituto di ricerca ed è stata ottenuta nel caso dei risultati mostrati in questo protocollo. Inoltre, dovrebbero essere effettuate relazioni adeguate per garantire la trasparenza e la riutilizzabilità dei dati nei futuri lavori9,29,30.
1. Preparazione di elettroliti di fondo (BGE)
NOTA: Tutti i solventi devono essere preparati in un'adeguata cappa aspirante e devono essere utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale per tutte le fasi (labcoat, guanti e occhiali). In ogni fase, sono necessari flaconcini di plastica a bassa legatura per ridurre al minimo la perdita di analita e la contaminazione del campione con sali lisciviati dalla vetreria.
<ol><li>Preparare il 10% di acido acetico BGE (v / v), pH 2,2 su base giornaliera per la metabolomica.<ol>
<li>In un matraccio volumetrico da 10 ml aggiungere 1 mL di acido acetico, seguito dall'aggiunta di acqua deionizzata (DI) alla linea contrassegnata e da un'accurata miscelazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 100 mM di acido acetico, pH 2,9 su base giornaliera per la proteomica.<ol>
<li>In un matraccio volumetrico da 10 ml aggiungere 57 μL di acido acetico, seguito dall'aggiunta di acqua DI alla linea contrassegnata e da un'accurata miscelazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione NM
<ol><li>Disperdere vigorosamente i NG in acqua utilizzando le linee guida pubblicate31,32,33. NOTA: Nello sviluppo di questo protocollo, sono stati utilizzati 7 NM come segue: 100 e 1.000 nm di polistirene carbossilato sono stati utilizzati rispettivamente per la proteina e il metabolita corona. 100 nm di POLISTIRENE NON MODIFICATO NMs, 13 nm anatasi TiO2 NM che erano non modificati o rivestiti con polimeri poliacrilati o PVP e 22 nm non modificato SiO2 NM nMs sono stati utilizzati sia per le corone proteiche che per i metaboliti. Mentre il metodo è stato sviluppato e dimostrato utilizzando questi NM, va notato che questo approccio sarebbe applicabile per una vasta gamma di composizioni, dimensioni, forme e morfologie NM.</li>
	<li>Caratterizzare la dimensione delle particelle utilizzando la diffusione dinamica della luce34,35,la spettrometria di massa al plasma accoppiata induttivamente a singola particella36,l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle37o la microscopia elettronica a trasmissione e la carica superficiale come potenziale zeta utilizzando un zeta sizer34.</li>
</ol>3. Formazione di corona biomolecolare
<ol><li>Dividere 2 mL di plasma umano (o biofluido a scelta) in aliquote da 1 mL, una per il metabolita e la proteina corona e la seconda per la caratterizzazione del metaboloma plasmatico.</li>
	<li>Incubare 1 mg/mL di NMs nel plasma umano per 1 ora a 37 °C mescolando delicatamente a 500 rpm in un bimbyxer. Dopo l'incubazione centrifugare il campione a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare le RM.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante plasmatico per l'analisi del metabolita corona. Mantenere il complesso corona NM-proteina per la caratterizzazione della corona proteica.</li>
</ol>4. Isolamento della corona proteica
<ol><li>Risospendare il complesso NM-proteina (il pellet) in 1 mL di 10x PBS Buffer e vortice vigorosamente per 2 minuti per rimuovere le proteine non legate. Centrifugare la soluzione PBS a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare le NN e rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Risospendare il pellet in 1 mL di tampone di bicarbonato di ammonio (ABC) (100 mM, pH 8,0) e vortici vigorosamente per 2 minuti per rimuovere le proteine non legate e i sali indesiderati. Centrifugare a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare i NN; rimuovere ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio.</li>
	<li>Ridurre i legami disolfuro proteico sciogliendo il pellet di proteina NM in 20 μL di tampone ABC (100 mM pH 8) contenente 10 mM di ditioteritolo. Incubare la soluzione di riduzione per 30 minuti a 56 °C.</li>
	<li>Per digerire le proteine, aggiungere 2 μg di tripsina di grado sequenziale a 20 μL di ABC contenente lo 0,1% di tensioattivo. Incubare la soluzione digestiva per 16 ore a 37 °C.</li>
	<li>Alchilare il campione con l'aggiunta di 20 μL di iodoacetammide a 55 mM in 100 mM ABC e incubare a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di 0,1 M HCl per fendere il tensioattivo e lasciare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Arricchire e desalt peptidi utilizzando una punta della pipetta dissalatrice confezionata C18.<ol>
<li>Bagnare la punta con 80 μL 0,1% acido formico 50% acetonitrile 5 volte, pulire con 80 μL 0,1% acido formico 5 volte, prelevare ed eluire il campione 10 volte, desaltare il campione lavando 80 μL 0,1% acido formico 5 volte ed eluire il campione 2 volte con 80 μL 0,1% acido formico 70% acetonitrile in un tubo PCR pulito a bassa legante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liofilizzare i campioni e conservare a -20 °C fino all'analisi.</li>
</ol>5. Isolamento del metabolita corona
<ol><li>Prendere il plasma di controllo e il surnatante dall'incubazione del plasma NM dalla fase 3.3 e mantenere il ghiaccio durante la preparazione del campione.</li>
	<li>Prendere 50 μL da ciascuno in flaconcini separati e diluire 1 su 10 con acqua DI. Prendere 50 μL di ciascun campione diluito e passare a nuovi flaconcini per il passaggio 5.3.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di cloroformio, 250 μL di metanolo e 350 μL di acqua DI e una miscela vigorosamente a vortice per 2 min. Centrifuga per 10 min a 20.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Prendere 500 μL di surnatante e filtrare attraverso un filtro centrifugo da 3 kDa per 2 ore a 10.000 x g a 4 °C. Prendere 430 μL di ultrafiltrato e asciugare in una velocità vac. I campioni possono ora essere congelati prima dell'analisi.</li>
</ol>6. Preparazione del sistema CESI-MS38
NOTA: Prima dell'installazione dei capillari, controllare che l'ingresso e l'estremità di uscita dei capillari siano intatti e che non vi siano rotture visibili nel capillare.
<ol><li>Installazione di un capillare rivestito neutro per l'analisi della corona proteica39.<ol>
<li>Inserire un nuovo capillare rivestito neutro (lunghezza 90 cm con diametro interno di 30 μm) nello strumento CESI seguendo le linee guida del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di capillari CESI per analisi proteomiche.<ol>
<li>Lavare il capillare di separazione in avanti utilizzando 100 mM di HCl per 5 minuti a 100 psi e verificare la presenza di goccioline all'uscita del capillare. Separazione capillare a filo con BGE a 100 psi per 10 min e poi acqua DI a 100 psi per 30 min (questo è richiesto solo per i nuovi capillari).</li>
		<li>Lavare sia il capillare di separazione che il capillare conduttivo con BGE a 90 psi per 5 minuti e assicurarsi che si formino goccioline all'estremità di uscita di entrambi i capillari.</li>
		<li>Lavare il capillare di separazione con acqua DI a 90 psi per 10 min, poi 50 psi per 10 min con 0,1 M HCl, seguito di nuovo da 90 psi per 10 min con acqua DI e infine BGE a 90 psi per 10 min. Accoppia CESI alla SM utilizzando una sorgente nanospray e un adattatore come descritto in precedenza38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installazione di capillare di silice fusa nuda per la caratterizzazione della corona del metabolita38.<ol>
<li>Inserire un nuovo capillare di silice fusa nuda (lunghezza 90 cm con un diametro interno di 30 μm) nello strumento CESI seguendo le linee guida del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione dei capillari CESI per l'analisi metabolomica.<ol>
<li>Lavare il capillare di separazione in avanti utilizzando MeOH al 100% a 50 psi per 15 minuti e verificare la presenza di goccioline all'uscita del capillare. Lavare sia il capillare di separazione che il capillare conduttivo con BGE a 90 psi per 5 minuti e assicurarsi che si formino goccioline all'uscita di entrambi i capillari.</li>
		<li>Lavare il capillare di separazione con acqua DI a 90 psi per 10 min, poi 50 psi per 10 min con 0,1 M NaOH, seguito di nuovo da 90 psi per 10 min con acqua DI e infine BGE a 90 psi per 10 min. Accoppia cesio all'ESI-MS utilizzando una sorgente nanospray e un adattatore come descritto in precedenza. 38 anni
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS per l'analisi della corona proteica
<ol><li>Sospendare i campioni dallo step 4.8 in 20 μL di 50 mM di acetato di ammonio pH 4.0.</li>
	<li>Eseguire l'iniezione idrodinamica 5 psi 10 s del campione. Separare utilizzando una tensione di separazione di 30 kV con il seguente gradiente di pressione: 0-10 min a 1 psi, 10-35 min a 1,5 psi e 35-45 min a 5 psi usando 100 mM, pH 2,9 acido acetico come BGE.</li>
	<li>Raccogli spettri di massa tra 250-2000 m/z con l'acquisizione di frammentazione dipendente dai dati top-10.</li>
	<li>Tra i campioni, risciacquare capillarmente con 0,1 M HCl per 3 min a 100 psi e 10 min 100 psi di BGE per la separazione capillare e per 3 min a 100 psi per il liquido conduttivo capillare.</li>
</ol>8. CESI-MS per l'analisi del metabolita corona
NOTA: Tutti i campioni devono essere analizzati due volte, una volta in modalità positiva per il rilevamento dei cationi e una volta in modalità negativa per la rilevazione degli anioni. I campioni di plasma di controllo devono essere analizzati almeno 5 volte.
<ol><li>Sospendare i campioni di plasma esposti e non esposti al NM dal passo 5.4 in 430 μL di acqua DI e vortice vigoroso per 2 min. Filtrare attraverso un filtro a membrana da 0,1 μm.</li>
	<li>Prendere 95 μL di filtrato e aggiungere 5 μL di standard interni a 200 μM per i cationi (L-metionina solfone) e 400 μM per gli anioni (acido 2,2,4,4-D4-citrico) e vortice vigorosamente. Centrifugare a 4.000 x g a 4 °C per 10 minuti prima dell'analisi CESI-MS.</li>
	<li>Iniettare il campione idrodinamicamente per 30 s (cationi) e 40 s (anioni) a 2 psi.</li>
	<li>Separare i metaboliti in acido acetico al 10% con una tensione di separazione di 30 kV in modalità avanti (cationi) e inversa (anioni). La modalità di separazione inversa è assistita da una pressione in avanti di 0,5 psi sul capillare di separazione.</li>
	<li>Impostare lo spettrometro di massa per raccogliere dati in modalità positiva (cationi) o negativa (anioni) nell'intervallo di massa 65-1000 m/z. Tra i campioni, risciacquare capillarmente con 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, acqua DI e BGE a 50 psi per 2 min.</li>
</ol>

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</ol>

J.A.T è un dipendente di AB Sciex UK Ltd che partecipa come partner industriale al progetto ACEnano, J.A.T e tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse in questo lavoro.

Questo è il primo metodo proposto per caratterizzare la corona biomolecolare completa incorporando proteine e metaboliti, dallo stesso campione, utilizzando CESI-MS. La capacità di caratterizzare sia le proteine che i metaboliti dello stesso campione aumenterà significativamente la quantità di dati raccolti da una singola esposizione sperimentale consentendo nuove informazioni sul processo di formazione della corona e sui suoi impatti per la tossicità e l'efficacia delle NN come nanofarmaci. Inoltre, CESI-MS è una piattaforma ideale per caratterizzare entrambe le classi di biomolecole con un solo cambio di capillare richiesto. Andando avanti, nuovi metodi sviluppati per la CE non acquosa consentiranno di eseguire la lipidomica utilizzando CE-MS40, quindi è ora possibile analizzare proteine, metaboliti e lipidi utilizzando un'unica piattaforma. Gli attuali approcci convenzionali richiederebbero due piattaforme LC-MS dedicate, una per la proteina corona e una per il metabolita corona. Pertanto, questo approccio può raccogliere il doppio dei dati utilizzando una singola piattaforma analitica.
Ci sono alcuni avvertimenti a questo approccio in particolare con il metabolita corona in quanto questo protocollo propone una misurazione indiretta della corona. Come tale, il problema può sorgere quando i livelli di metaboliti sono presenti ad alte concentrazioni rispetto alle NN e il successivo calo della concentrazione di metaboliti nella matrice è piccolo. Tuttavia, a differenza della corona proteica, è improbabile che venga sviluppato un approccio "taglia unica" per isolare il metabolita corona a causa del fatto che ogni NM ha sostanze chimiche di superficie uniche. Andando avanti è più probabile che vengano sviluppati e convalidati approcci specifici per la NM per isolare il metabolita corona; questo sarà applicabile solo a quello specifico NM. Nonostante ciò, il CESI-MS sarà comunque una piattaforma altamente adatta per la caratterizzazione dei metaboliti polari carichi indipendentemente da come sono isolati. Degno di nota è anche il fatto che se un pellet non si forma durante le fasi di centrifugazione progettate per pellettare le NM, può essere necessaria una forza centrifuga più elevata; questo è più probabile che si verifichi con NN meno densi. È anche fondamentale che tutte le fasi di filtraggio siano rispettate all'interno del protocollo a causa dello stretto foro dei capillari che possono facilmente bloccarsi se il particolato non è stato adeguatamente eliminato dal campione.
Mentre la proteina corona è stata un'intensa area di ricerca per un certo numero di anni, la capacità di combinarlo con il metabolita corona è un nuovo campo di interesse per gli scienziati che studiano l'interfaccia bio-nano6,14. Ad oggi, la maggior parte di questi studi si è concentrata sulla frazione lipidica non polare del metabolita corona9,28. Questo metodo attuale consente la caratterizzazione dei metaboliti altamente polari e carichi nella corona che include importanti metaboliti coinvolti nel metabolismo energetico, nella glicolisi e nella sintesi del DNA. Di conseguenza, se combinato con il flusso di lavoro proteomico, è possibile una caratterizzazione più olistica della corona biomolecolare. Ciò consente un'analisi più approfondita delle interazioni bio-nano in futuro. Questo metodo consente una migliore conoscenza meccanicistica dell'endocitosi mediata dai recettori attraverso le interazioni di proteine e metaboliti con i recettori di membrana. Inoltre, possono essere esplorate le interazioni inter e intra corona tra proteine e piccole molecole; ad esempio, è stato recentemente dimostrato che le proteine nella corona svolgono un ruolo chiave nel reclutamento dei metaboliti15. Vale la pena notare che i risultati rappresentativi nella Figura 3 e nella Figura 4 sono la quantificazione assoluta dei metaboliti, tuttavia, un approccio non targeting che utilizza l'analisi dei dati multivariati per confrontare tutte le caratteristiche CE-MS nei controlli rispetto al plasma esposto chiarirebbe anche il legame con il metabolita. Pertanto, c'è uno spazio significativo per indagare come e quali metaboliti e proteine influenzano il loro rispettivo reclutamento nelle corone NM. Questi studi aggiuntivi possono aiutare a progettare corone per ottimizzare la consegna di nanofarmaci o scoprire ulteriori ostacoli al loro sviluppo come la soppressione dell'azione farmaceutica a causa del blocco biomolecolare della corona o delle funzionalità di targeting del mascheramento.
CESI-MS con le sue portate su scala nanometrica di circa 20 nL/ min e l'uso minimo di solventi organici offre un miglioramento delle credenziali verdi ed economiche rispetto agli standard LC-MS e nanoLC-MS in termini di uso di solventi, le principali sfide per gli studi di metabolomica e proteomica, rispettivamente. CESI-MS offre risultati altamente riproducibili sia per il tempo di migrazione che per l'area di picco che si confrontano favorevolmente con i metodi basati su LC-MS11,15. Inoltre, rispetto ai nanoLC-MS, il carry-over non è un problema nel CESI-MS. Pertanto, non è necessaria un'ampia pulizia del sistema tra le analisi dei campioni, il che migliora notevolmente la produttività del campione11.
In sintesi, il flusso di lavoro proposto è il primo a dettagliare un approccio per caratterizzare sia le componenti proteiche che metabolite della corona biomolecolare completa delle RM. Ciò sblocca un nuovo aspetto delle interazioni bio-nano, il metabolita corona, consentendo così la raccolta di due volte più dati dallo stesso campione, consentendo una comprensione più completa delle interazioni all'interfaccia bio-nano.

Le interazioni bio-nano, all'interfaccia tra superfici di nanomateriali (NM) e matrici biologiche da cui le biomolecole assorbono al NM, sono un'intensa area di ricerca alla base della nanosicurezza e della nanomedicina1. Questo strato di biomolecole adsorbite conferisce un'identità biologica alle RM, quindi le cellule le identificano come "sé", influenzando successivamente l'assorbimento cellulare, la distribuzione e gli endpoint biologici2,3,4. La stragrande maggioranza degli studi bio-nano si è concentrata sulle proteine all'interno della corona e ha dimostrato che le proteine variano quantitativamente e qualitativamente tra LE NN di diverse composizioni5. Questa variazione dipende sia dalle proprietà del NM come dimensioni, funzionalizzazione e materiale, sia dalle proprietà della matrice biologica, compresa la composizione e il contenuto di sale5. Una crescente area di interesse nell'interfaccia bio-nano sono i metaboliti che assorbono aNN 6. Diversi studi hanno dimostrato che, come per le proteine, le proprietà NM sono un fattore chiave nel determinare la composizione dei metaboliti nella corona e che possono influenzare gli esiti biologici dell'esposizione a NM6,7,8.
Negli studi della corona biomolecolare ci sono quattro fasi distinte per la sua caratterizzazione, la formazione della corona, l'isolamento delle biomolecole all'interno della corona, la loro rilevazione tramite spettrometria di massa qualitativa o quantitativa e l'identificazione9. Ad oggi, sono state adottate una serie di tecniche per isolare la corona proteica, tra cui l'ebollizione nel tampone di funzionamento SDS-PAGE, le estrazioni con solvente e sale o la digestione diretta delle proteine in situ sulla superficie delle RM. In termini di metaboliti nella corona, l'isolamento è più complesso con vari metodi che utilizzano solventi o anche la dissoluzione dei NN proposti come soluzioni8,10,11. Tuttavia, a differenza della corona proteica, è improbabile che un approccio "taglia unica" si applichi all'isolamento dei metaboliti dalle MM, a causa dell'ampio spazio chimico occupato dal metaboloma e della diversità dei possibili MM. Un approccio alternativo consiste nel caratterizzare la matrice biologica prima e dopo l'esposizione a NM con la differenza nelle concentrazioni di metaboliti attribuita all'adsorbimento dei metaboliti alle NM.12
Questo approccio alternativo sarebbe applicabile a tutti i biofluidi e NM e, sebbene richieda il doppio dell'analisi, offre di conseguenza una misura molto più precisa del metabolita corona e non ha alcun rischio che i recuperi a basso metabolita dalla superficie NM vengano scambiati per basso legame del metabolita specifico.
Il secondo passo per l'analisi biomolecolare della corona è la rilevazione delle biomolecole. Tradizionalmente per le proteine nella corona, questo è stato il mandato della nano-LC-MS, il cavallo di battaglia della proteomica; sono stati applicati anche altri approcci come NMR13, 1D e 2D SDS-PAGE. In termini di metabolita corona LC-MS7,GC-MS8 e spettrometria di massa ad infusione diretta sono stati utilizzati14. Tuttavia, un nuovo approccio ha recentemente iniziato a guadagnare trazione, vale a dire elettroforesi capillare-spettrometria di massa (CE-MS)11,15 ed è stato presente nei laboratori NM come tecnica autonoma per caratterizzare varie proprietà fisiche e chimiche di NM16. CE-MS è una tecnica di separazione ortogonale a nanoLC-MS e GC-MS ed è in grado di consentire la rilevazione di metaboliti altamente polari e carichi17,18. Inoltre, CE-MS è adatto per l'analisi delle proteine e delle loro modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione e la glicosilazione19,20,21,22. La fase finale, l'identificazione e l'analisi dei dati possono essere eseguite in diversi modi a seconda che venga utilizzato un approccio quantitativo / qualitativo o mirato / non mirato, questo, tuttavia, esula dal mandato di questo protocollo.
CESI-MS, una combinazione di CE e un'interfaccia nanoESI, è un recente progresso nella tecnologia CE che utilizza un'interfaccia senza guai. Ciò consente il collegamento diretto di CE a flusso ultra-basso (<20 nL / min) a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione senza diluizione, con conseguente sensibilità di rilevamento significativamente migliorata23,24,25. CESI-MS consente di analizzare campioni a volume limitato (< 10 μL) mantenendo un'analisi altamente sensibile26. CESI-MS si confronta anche favorevolmente con i tradizionali approcci nanoLC-MS a bassa portata utilizzati in proteomica e metabolomica in termini di riproducibilità27,28,throughput e carry over, rendendolo una prospettiva entusiasmante per la caratterizzazione completa della corona biomolecolare.
Per evidenziare il potenziale del CESI-MS per le analisi delle interazioni bio-nano, questo lavoro descrive la preparazione del campione necessaria per isolare la corona biomolecolare NM da un singolo campione di plasma umano in modo tale da massimizzare i dati sia dagli aspetti proteici che da quelli metabolitici della corona NM biomolecolare completa. Mentre riportiamo sull'uso del plasma umano, questo protocollo sarebbe ugualmente appropriato per altri biofluidi come il siero del sangue, il terreno di coltura cellulare completo, il lisato cellulare, il liquido cerebrospinale o l'urina. Le analisi di questi due componenti (proteine e metaboliti) saranno poi descritte utilizzando capillari CESI rivestiti neutri per la corona proteica e capillari di silice fusi nudi per metaboliti sia cationici che anionici.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditiotreitolo</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citrico</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Anione standard interno</td></tr><tr><td>Acetato di ammonio >98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio >99,5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerante a cartuccia capillare</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 strumento</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Fiale</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Tossico, uso in cappa aspirante</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Catione standard interno</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Utilizzo in cappa aspirante</td></tr><tr><td>Microfiale</td><td>Sciex</td><td>144709</td> nanoFiale Sciex 5043467 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia a superficie neutra 30 &; M ID x 90 cm di lunghezza totale</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adattatore per sorgente Sciex Nanospray III</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 e B83386 per spettrometri di massa Thermo, B85397 per spettrometri di massa Waters, B86099 per spettrometri di massa Bruker</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &; m ID x 90 cm di lunghezza totale</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata Phospahte 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Punte, 100 &; L letto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene carbossilato 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene carbossilato 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (tensioattivo)</td><td>Acque</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Grado di sequenziamento modificato Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr>Particelle di <td>promezio</td><td>rivestite in TiO2 Dispex</td> Particelle <td></td><td>su misura</td></tr><tr>Particelle di <td>promezio</td><td>rivestite in TiO2 PVP</td><td>Particelle</td><td></td>su misura</tr><tr>Particelle di <td>promezio</td> <td>non rivestite TiO2</td><td>Particelle</td><td></td> su misura</tr></tbody></table>

approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita corona acquisiti da nanomateriali

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

L'adsorbimento delle biomolecole dalle matrici biologiche circostanti alla superficie dei nanomateriali (NN) per formare la corona è stato di interesse negli ultimi dieci anni. L'interesse per l'interfaccia bio-nano nasce dal fatto che la corona biomolecolare conferisce un'identità biologica alle RM e quindi induce il corpo a identificarle come "sé". Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che le proteine nella corona sono in grado di interagire con i recettori di membrana per influenzare l'assorbimento cellulare e hanno stabilito che la corona è responsabile del traffico cellulare di NG e della loro eventuale tossicità. Ad oggi, la maggior parte della ricerca si è concentrata sulla proteina corona e ha trascurato i possibili impatti dei metaboliti inclusi nella corona o gli effetti sinergici tra i componenti della corona biomolecolare completa. Come tale, questo lavoro dimostra metodologie per caratterizzare sia i componenti proteici che quelli metaboliti della corona biomolecolare utilizzando approcci di proteomica e metabolomica bottom-up in parallelo. Ciò include un digest su particella della corona proteica con un tensioattivo utilizzato per aumentare il recupero proteico e una caratterizzazione passiva del metabolita corona analizzando le matrici di metaboliti prima e dopo le esposizioni NM. Questo lavoro introduce l'elettroforesi capillare – spettrometria di massa (CESI-MS) come nuova tecnica per la caratterizzazione della corona NM. I protocolli qui delineati dimostrano come CESI-MS possa essere utilizzato per la caratterizzazione affidabile sia della proteina che del metabolita corona acquisiti dalle RM. Il passaggio a CESI-MS riduce notevolmente il volume di campione richiesto (rispetto ai tradizionali approcci di cromatografia liquida – spettrometria di massa (LC-MS)) con iniezioni multiple possibili da un minimo di 5 μL di campione, rendendolo ideale per campioni a volume limitato. Inoltre, le conseguenze ambientali dell'analisi sono ridotte rispetto a LC-MS a causa delle basse portate (<20 nL/min) in CESI-MS e dell'uso di elettroliti acquosi che eliminano la necessità di solventi organici.

Il metodo descritto è il primo a caratterizzare sia le proteine che i metaboliti nella corona biomolecolare NM utilizzando lo stesso campione di plasma umano. Questo metodo è in grado di rilevare &gt;200 proteine e metaboliti &gt;150, consentendo così di determinare la panoramica più completa della corona biomolecolare completa, consentendo una migliore comprensione dell'attaccamento cellulare, dell'assorbimento e degli impatti delle RM.
L'uso di CESI-MS sia per la separazione e la rilevazione della proteomica (Figura 1) che per la metabolomica (Figura 2) mostra buone finestre di separazione su entrambi i capillari per ciascun approccio.
Questo metodo è in grado di distinguere tra le proteine nella corona in un'ampia gamma di composizioni di NN, dimostrando così l'applicabilità dei metodi alle NN in un'ampia gamma di caratteristiche fisiche e chimiche (Tabella 1).
Le impronte digitali uniche del metabolita corona possono anche essere distinte usando il ramo metabolomico di questa metodologia (Figura 3). Sebbene questo approccio utilizzi un approccio passivo per caratterizzare il metabolita NM corona, è ancora in grado di scoprire interessanti approfondimenti sul ruolo dei metaboliti nella corona biomolecolare come l'adsorbimento differenziale degli isomeri (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figura 1: Elettroferogramma esemplare di una separazione corona della proteina SiO2 utilizzando CESI-MS a seguito di un digest su particella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figura 2: Esempio di elettroferogrammi ionici estratti ottenuti da composti endogeni nel plasma da CE-MS. I composti numerato sono i seguenti: 1. Ornitina; 2. Lisina; 3. Arginina; 4. Istidina; 5. Creatina; 6. Glicina; 7. Alanina; 8. Valina; 9. Isoleucina; 10. Leucina; 11. Serina; 12. Treonina; 13. Asparagina; 14. Metionina; 15. Glutammina; 16. Acido glutammico; 17. Fenil-D5-alanina; 18. Fenilalanina; 19. Tirosina; 20. Prolina; 21. Metionina solfone (standard interno). Pubblicato sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto e riprodotto da Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Analisi della corona proteica in una serie di 6 NMs. Mappa termica delle classi proteiche identificate su silice (SiO2), titania (TiO2), titania ricoperta di PVP (TiO2-PVP), titania ricoperta di dispex (TiO2-Dispex), polistirene e polistirene CARBOSSILATO NMs. Le percentuali si riferiscono all'abbondanza delle proteine rispetto al contenuto proteico totale in base all'abbondanza dei primi 3 peptidi per ciascuna proteina. Date le differenze osservate nelle abbondanze relative di proteine nelle diverse corone NM, è chiaro che questo protocollo proposto è sufficientemente sensibile per distinguere tra la corona proteica di diversi NM. Figura riprodotta da un'analisi CESI-MS della corona proteica, pubblicata sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figura 3: Analisi mirata dei metaboliti cationici nella corona NM. Adsorbimento dei cationi a SiO2 e TiO2 NMs. Il rosso si riferisce alla concentrazione iniziale dei metaboliti mentre il blu si riferisce alla concentrazione di metaboliti dopo un'incubazione di 1 ora con i NN a 37 °C. La riduzione della concentrazione del metabolita nella soluzione è il risultato dell'adsorbimento del metabolita sulla superficie NM. Non è stato osservato alcun adsorbimento significativo dei metaboliti per i NN di polistirene. I box plot rappresentano i valori minimo e massimo, gli intervalli mediani e interquartili. Figura riprodotta da un'analisi mirata CESI-MS del metabolita corona pubblicata sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figura 4: Analisi mirata dei metaboliti anionici nella corona NM con particolare attenzione all'adsorbimento degli isomeri. L'adsorbimento degli anioni in una gamma di TITANIA NMs mostra chiare differenze tra vari isomeri come i fosfati di zucchero. Il rosso si riferisce alla concentrazione iniziale di metaboliti mentre il blu si riferisce alla concentrazione di metaboliti dopo un'incubazione di 1 ora con il NM a 37 °C. La riduzione della concentrazione del metabolita in soluzione è il risultato dell'adsorbimento del metabolita sulla superficie NM. Non è stato osservato alcun adsorbimento significativo dei metaboliti per il SiO2 e il polistirene NMs. I box plot rappresentano i valori minimo e massimo, gli intervalli mediani e interquartili. Figura riprodotta da un'analisi mirata CESI-MS del metabolita corona pubblicata sotto una licenza Creative Common CC BY ad accesso aperto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analita</td>
			<td>Area media di picco RSD</td>
			<td>Tempo medio di migrazione RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptidi intraday (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationi infragiogiosi (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationi inter-giorno (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Riproducibilità delle repliche tecniche CESI-MS per peptidi e metaboliti cationici. RSD: deviazione standard relativa, come misura di riproducibilità. La riproducibilità del CESI-MS in termini di aree di picco e tempi di migrazione è molto buona, con tutti gli analiti che hanno un RSD medio &lt;15% e i tempi di migrazione &lt;2,2%. Questi risultati dimostrano l'elevato grado di confidenza che può essere attribuito ai dati raccolti utilizzando questa tecnica e confermano che le variazioni rilevate sono dovute a differenze reali nella composizione del campione (arricchimento su NN) piuttosto che alla variazione analitica. La Tabella 2 è generata dai risultati presentati in precedenza11,15.

Qui presentiamo un protocollo per caratterizzare la corona biomolecolare completa, le proteine e i metaboliti, acquisiti dai nanomateriali dai biofluidi utilizzando un approccio di elettroforesi capillare – spettrometria di massa.

Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Questo protocollo è il primo ad implementare CESI-MS per la caratterizzazione non solo della corona proteica, ma anche della corona dei metaboliti dei nanomateriali. CESI offre una separazione ortogonale ai metodi LCMS tradizionali, che è altamente riproducibile e sensibile utilizzando solo pochi nanolitri di campione. Per iniziare, dividere due millilitri di plasma umano in aliquote da un millilitro, una per il metabolita e la corona proteica e una per la caratterizzazione del metaboloma plasmatico.Incubare un milligrammo per millilitro di nanomateriali nel plasma umano per un'ora a 37 gradi Celsius mescolando delicatamente a 500 rotazioni al minuto in un termomiscelatore. Quindi, pellettare i nanomateriali centrifugando a 4.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante plasmatico per l'analisi della corona del metabolita e conservare il complesso corona proteico del nanomateriale per la caratterizzazione della corona proteica.Risospendere il pellet in un millilitro di tampone PBS 10X e agitare energicamente per due minuti per rimuovere le proteine non legate. Centrifugare la soluzione a 4.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i nanomateriali, quindi rimuovere il surnatante con cura senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone ABC e agitare energicamente per due minuti per rimuovere le proteine e i sali non legati.Ripetere la fase di centrifugazione ed eliminare il surnatante. Sciogliere il pellet in 20 microlitri di tampone ABC contenente 10 millimolari di ditiotreitolo per ridurre i legami disolfuro proteico. Incubare la soluzione per 30 minuti a 56 gradi Celsius.Aggiungere due microgrammi di tripsina di grado sequenziale ai 20 microlitri di tampone ABC contenente lo 0,1% di tensioattivo e incubare la soluzione digestiva a 37 gradi Celsius per 16 ore. Alchilare il campione aggiungendo 20 microlitri di iodoacetammide da 55 millimolari in ABC da 100 millimolari e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere 20 microlitri di acido cloridrico molare 0,1 per scindere il tensioattivo e lasciare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente.Arricchire e dissalare i peptidi utilizzando un puntale per pipetta di desalinizzazione confezionato in C18 come descritto nel manoscritto del testo. Quindi liofilizzare il campione e conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino all'analisi. Prelevare il plasma di controllo e il surnatante dall'incubazione del plasma nanomateriale e metterli in ghiaccio.Aliquotare 50 microlitri da ciascun campione in fiale separate e diluire dieci volte con acqua distillata. Dopo il vortex, spostare 50 microlitri di questo campione diluito in nuove fiale. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio, 250 microlitri di metanolo e 350 microlitri di acqua distillata e agitare energicamente per due minuti.Centrifugare a 20, 800 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Prelevare 500 microlitri di surnatante e filtrarlo attraverso un filtro centrifugo da tre kilodalton per due ore a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius. Asciugare 430 microlitri di ultra filtrato in uno speed vac e congelare il campione.Prima dell'installazione dei capillari nello strumento CESI, verificare che le estremità di ingresso e uscita dei capillari siano intatte e che non vi siano rotture visibili nel capillare. Quindi posizionare un nuovo capillare neutro codificato nello strumento, seguendo le linee guida del produttore. Lavare il capillare di separazione in avanti con acido cloridrico 100 millimolare, quindi con BGE e infine con acqua distillata, utilizzando le condizioni descritte nel manoscritto del testo.Quindi lavare sia il capillare di separazione che quello conduttivo con BGE, seguito da acqua distillata, acido cloridrico 100 millimolare, di nuovo acqua distillata e infine con BGE. Accoppiare CESI all'MS utilizzando la sorgente di spray nano e l'adattatore. Per l'analisi della corona proteica, risospendere i campioni liofilizzati in 20 microlitri di acetato di ammonio da 50 millimolari a pH quattro.Eseguire l'analisi CESI-MS per i campioni come descritto nel manoscritto del testo. Raccogli dati sugli spettri di massa tra 250 e 2.000 m/z, con l'acquisizione della frammentazione dipendente dai primi 10 dati, e risciacqua il capillare tra i campioni. Posizionare un nuovo capillare di silice fusa nuda nello strumento CESI.Lavare il capillare di separazione in avanti utilizzando metanolo al 100%, quindi lavare sia il capillare di separazione che quello conduttivo con BGE per garantire la formazione di goccioline alle estremità di uscita. Quindi sciacquare il capillare con acqua distillata, seguita da idrossido di sodio 0,1 molare, di nuovo acqua distillata e infine con BGE. Accoppiare CESI al SEMS utilizzando la sorgente di spray nano e l'adattatore.Per eseguire l'analisi della corona dei metaboliti, risospendere i campioni di plasma nanomateriale esposti e non esposti in 430 microlitri di acqua distillata e agitare vigorosamente per due minuti. Filtrare i campioni attraverso un filtro a membrana da 0,1 micrometri. Aggiungere cinque microlitri degli standard interni, come menzionato nel manoscritto del testo, a 95 microlitri di filtrato e agitare energicamente.Centrifugare a 16, 100 volte G e quattro gradi Celsius. Eseguire l'analisi CESI-MS per i campioni come descritto nel manoscritto del testo. L'uso di CESI-MS per la separazione e la rilevazione proteomica e metabolomica dimostra buone finestre di separazione su entrambi i capillari per ogni approccio, consentendo una caratterizzazione completa della corona biomolecolare.Il metodo proteomico CESI-MS è in grado di distinguere tra una serie di proteine e concentrazioni proteiche nella corona attraverso un'ampia gamma di composizioni di nanomateriali e può distinguere una corona proteica unica per ogni nanomateriale. Questo approccio metabolomico CESI-MS consente un'analisi quantitativa del metabolita corona e può essere utilizzato per scoprire le sue impronte digitali uniche. Sebbene questo approccio caratterizzi passivamente la corona del metabolita del nanomateriale, è ancora in grado di scoprire interessanti intuizioni sul ruolo dei metaboliti nella corona biomolecolare, come l'assorbimento differenziale degli isomeri.Questa tecnica consente di caratterizzare sia la proteina che il metabolita corona, consentendo una migliore comprensione di come la corona biomolecolare completa influenzi l'assorbimento dei nanomateriali da parte delle cellule.

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Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

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