Caratterizzazione spettroscopica UV-Vis di nanomateriali in mezzi acquosi
25 ottobre 2021
Questo studio presenta i risultati del benchmarking per un confronto interlaboratorio (ILC) progettato per testare la procedura operativa standard (SOP) sviluppata per le dispersioni colloidi d'oro (Au) caratterizzate da spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), tra sei partner del progetto H2020 ACEnano per la preparazione, la misurazione e l'analisi dei risultati del campione.
La spettrofotometria UV-Vis è una tecnica consolidata, facile da usare ed economica per misurare le dimensioni, la concentrazione, lo stato di aggregazione e l'indice di rifrazione dei nanomateriali. UV-Vis fornisce uno screening e una valutazione non invasivi e rapidi in tempo reale delle caratteristiche dei nanomateriali utilizzando semplici misurazioni di assorbimento. UV-Vis è eccezionalmente semplice.
I campioni richiedono poca preparazione e il software ha poche variabili ed è facile da usare. Accendere lo spettrometro UV-Vis per almeno 20 minuti per consentire alla lampada di riscaldarsi. Caricare il software e selezionare Collega lo strumento Selezionare l'opzione Spectrum Scan dalla finestra della modalità che visualizza le modalità operative.
Nel software, fare clic su Strumento e andare su Impostazioni nella barra dei comandi, selezionare Parametri per la scansione dello spettro, quindi regolare le impostazioni per la misurazione. Vai alla scheda Strumento e seleziona ABS per la modalità dati e La larghezza della fessura è di 1,5. Vai alla scheda Scansione lunghezza d'onda e imposta una lunghezza d'onda iniziale di 680 nanometri, una lunghezza d'onda finale di 380 nanometri e una velocità di scansione di 400 nanometri al minuto.
Dopo aver impostato i parametri, riempire due cuvette con un millilitro di acqua ultra pura e posizionarle nel supporto della cella di riferimento e del campione per coprire il percorso della luce. Chiudere il coperchio dello strumento e continuare con la calibrazione vuota selezionando blank dalla barra dei comandi, quindi selezionare OK. Prendi un sottocampione di 500 microlitri di ogni campione di nanoparticelle d'oro e prepara una diluizione con 500 microlitri di acqua ultrapura. Posizionare le diluizioni in cuvette da un millilitro con una concentrazione finale di 25 microgrammi per millilitro.
Eseguire una calibrazione vuota. Dopo la calibrazione in bianco, sostituire una delle cuvette vuote nel portacelle del campione con un campione di nanoparticelle d'oro, mantenendo intatta la cuvetta di riferimento. Selezionare misura Start nella barra dei comandi per eseguire la scansione.
Esegui tre scansioni dello spettro per ogni campione di nanoparticelle d'oro diluito e campione sconosciuto. Estrarre i dati sperimentali grezzi per ogni misurazione in un file compatibile con un foglio di calcolo. Selezionare Proprietà nella scansione, sulla barra dei comandi, passare alla scheda Stampa/Esporta, fare clic su Dati, Spettro e parametri e premere OK. Fare clic su Salva sulla barra dei comandi e salvare i dati come file xls.
Annotare la lunghezza d'onda massima di assorbimento e lambda per ciascuna delle letture e registrarle nel modello fornito. Traccia una curva di calibrazione con la media di lambda massima rispetto alla dimensione delle nanoparticelle selezionando i dati, inserisci il grafico, il grafico a dispersione, aggiungi la linea di tendenza e la curva polinomiale. Per includere l'equazione polinomiale per la curva di calibrazione, selezionate Opzioni linea di tendenza e Visualizza equazione sul grafico dalla barra dei comandi.
Infine, calcola la dimensione del campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto isolando l'equazione polinomiale dalla curva di calibrazione per adattarla al valore medio per la lambda massima sconosciuta usando una derivazione della formula quadratica. Tra i sei laboratori, la lunghezza d'onda massima ha mostrato una stretta ripetibilità, mentre i risultati della massima assorbanza hanno mostrato una gamma più sparsa di valori di dati per diverse dimensioni di nanoparticelle d'oro. Gli intervalli e i mezzi complessivi per ogni dimensione della nanoparticella d'oro sono mostrati qui.
Il valore massimo di Z-score per lambda max è stato riportato dal laboratorio tre per le nanoparticelle di dimensioni di 5 nanometri e il punteggio z più alto per la massima assorbanza è stato riportato dal laboratorio uno per nanoparticelle di dimensioni di 40 nanometri. La maggior parte dei partner ha calcolato che la dimensione della nanoparticella sconosciuta è compresa tra 76 e 80 nanometri, con cinque laboratori che riportano una dimensione superiore anomala di 109 nanometri. I punteggi Z per dimensioni sconosciute sono stati calcolati tra meno 0,25 e meno 0,56 per tutti i laboratori, con l'unica eccezione riportata dal laboratorio cinque, che ha mostrato il più alto punteggio Z positivo di 2,03.
Assicurarsi che i parametri e le impostazioni siano stati regolati correttamente. I campioni diluiti devono essere preparati freschi prima della misurazione con UV-Vis. UV-Vis può essere facilmente combinato con altri strumenti, come TEM, DLS e AFM per misurare una grande varietà di attributi se gli utenti desiderano caratterizzare il loro campione in modo più completo.
Panoramica
Questo studio stabilisce un confronto interlaboratorio (ILC) per valutare la procedura operativa standard (SOP) relativa alle dispersioni colloidali di oro (Au) mediante spettroscopia UV-Vis. Sei partner del progetto H2020 ACEnano hanno partecipato allo studio, concentrandosi sulla preparazione del campione, sulla misurazione e sull'analisi dei risultati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nanomateriali
- Chimica analitica
- Confronti interlaboratorio
Sfondo
- La spettrofotometria UV-Vis è una tecnica ampiamente utilizzata per la caratterizzazione dei nanomateriali.
- Il metodo è non invasivo e consente la valutazione in tempo reale delle caratteristiche del campione.
- Semplici misure di assorbimento forniscono informazioni su dimensione, concentrazione e stato di aggregazione.
- Le procedure operative standard sono essenziali per ottenere risultati coerenti tra diversi laboratori.
Scopo dello studio
- Confrontare il PDT per le dispersioni di colloidi d'oro tra più laboratori.
- Valutare la ripetibilità e l'affidabilità delle misure UV-Vis.
- Analizzare i risultati e identificare le discrepanze nelle misurazioni della dimensione delle nanoparticelle.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di campioni e diluizioni di nanoparticelle d'oro.
- Calibrazione dello spettrometro UV-Vis e misure del bianco.
- Esecuzione di scansioni spettrali multiple per ciascun campione.
- Estrazione e analisi dei dati per determinare le dimensioni delle nanoparticelle.
Risultati principali
- Ripetibilità elevata nelle misurazioni della lunghezza d'onda massima tra diversi laboratori.
- Variabilità nei risultati di assorbanza massima per dimensioni diverse delle nanoparticelle.
- La maggior parte dei laboratori ha stimato dimensioni delle nanoparticelle sconosciute comprese tra 76 e 80 nanometri.
- Il laboratorio cinque ha riportato una dimensione anomala di 109 nanometri.
Conclusioni
- Lo studio sottolinea l'importanza di procedure standardizzate per le misurazioni UV-Vis.
- Le discrepanze nei dati di assorbanza indicano la necessità di ulteriori indagini.
- La collaborazione tra laboratori può migliorare l'accuratezza e l'affidabilità delle misurazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La spettroscopia UV-Vis consente un'analisi rapida e non invasiva della dimensione, concentrazione e stato di aggregazione dei nanomateriali, supportando la caratterizzazione fisico-chimica nelle fasi iniziali dello sviluppo della nanomedicina. Protocolli standardizzati migliorano la riproducibilità tra laboratori, riducendo la variabilità nella valutazione preclinica dei nanomateriali. Ciò aumenta la fiducia predittiva nella selezione dei candidati principali e riduce i rischi associati al comportamento inconsistente dei nanomateriali nei sistemi biologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle proprietà fisico-chimiche dei nanomateriali che influenzano le interazioni biologiche e il legame con la molecola bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce una valutazione iniziale rapida ed economica per selezionare i candidati nanomateriali da sottoporre a ulteriori valutazioni.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi di assorbanza adatti per definire curve di calibrazione e relazioni tra dimensione e concentrazione.
- Valore operativo: Supporta la standardizzazione dei saggi mediante intervalli di lunghezze d'onda definiti, velocità di scansione e ampiezze di fessura per misurazioni riproducibili.
- Valore strategico: Favorisce la predisposizione a schermate ad alto rendimento consentendo il monitoraggio in tempo reale dell'aggregazione e della stabilità.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce metriche ripetibili di dimensione e aggregazione fondamentali per correlare le proprietà dei nanomateriali con l'efficacia preclinica e gli esiti tossicologici.
- Valore operativo: Permette il confronto dei dati tra laboratori quando vengono seguiti i protocolli operativi standard, sostenendo studi preclinici multicentrici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La caratterizzazione UV-Vis si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla sintesi iniziale dei nanomateriali fino alla valutazione preclinica, specialmente quando integrata con tecniche ortogonali come la TEM o la DLS per un profilo completo.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo al modo in cui dimensioni e aggregazione influenzano l'assorbimento cellulare e il legame al bersaglio.
- Screening: Permette la prontezza del saggio fornendo un feedback rapido in tempo reale sulla stabilità dei nanomateriali durante l'incubazione con i composti.
- Analisi: Fornisce valori di lambda max e di assorbanza che consentono di stimare dimensioni e stato di aggregazione mediante curve di calibrazione.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica offrendo un metodo standardizzato per monitorare le proprietà dei nanomateriali in diverse condizioni di formulazione e conservazione.
- Riutilizzo Aziendale: Rappresenta una capacità scalabile e riutilizzabile per il controllo qualità dei nanomateriali in tutte le fasi della scoperta e dello sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nelle previsioni sul comportamento dei nanomateriali riducendo l'ambiguità meccanicistica derivante da campioni scarsamente caratterizzati.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità tra laboratori e progetti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati fisico-chimici affidabili fin dalle fasi iniziali dello sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi basata su profili dimensionali e di aggregazione coerenti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in spettrofotometria e manipolazione di nanomateriali per garantire una corretta preparazione del campione e la calibrazione dello strumento.
- È fortemente dipendente dalla stabilità della sorgente luminosa e dall'accuratezza della lunghezza d'onda, richiedendo un regolare tempo di riscaldamento dello strumento e una manutenzione periodica.
- Necessita di un accordo condiviso tra i team su procedure operative standard (SOP) riguardo ai fattori di diluizione, alla selezione delle cuvette e ai formati di esportazione dei dati, al fine di assicurare la comparabilità.
- Deve tenere conto delle limitazioni nella rilevazione di nanomateriali inferiori a 5 nm o presenti in matrici biologiche complesse senza una pre-purificazione.
- Tragge vantaggio dall'integrazione con tecniche complementari (ad esempio, TEM, DLS) per una caratterizzazione fisico-chimica completa quando lo spettro UV-Vis da solo non è sufficiente.
