Approccio sistematico per identificare nuove molecole antimicrobiche e antibiofilm dagli estratti e dalle frazioni delle piante per prevenire la carie dentale

Il protocollo presentato viene utilizzato per lo screening e l'analisi corretti dei candidati bioattivi nei prodotti naturali per controllare i biofilm orali. Può anche essere adattato per applicazioni in altri campi di ricerca sul biofilm. Questo metodo di screening e analisi della maggior parte degli amidi consente di rimuovere contemporaneamente i componenti bioattivi.

La carie dentale è una dieta biofilm derivata, altamente prevalente, malattia cronica. Questo protocollo può aiutare a identificare i prodotti naturali per controllare i biofilm e, di conseguenza, la carie dentale. Iniziare preparando il solvente da estrazione con una miscela idroalcolica.

Campionare concentrazioni tra 50 e 100 milligrammi per millilitro del solvente da estrazione ed eseguire estrazioni assistite da ultrasuoni di 15 minuti in microtubi. Ripetere l'estrazione tre volte. Dopo ogni fase di estrazione, centrifugare il campione per decapare il residuo solido e rimuovere il supernatante.

Unire i supernaganti di ogni fase di estrazione e filtrarli. Salvare le aliquote per l'analisi chimica e i biosatti. Per il frazionamento, diluire il campione di estratto grezzo per ottenere una soluzione di 100 milligrammi per millilitro, utilizzando il solvente da estrazione iniziale.

Quindi, trasferire un millilitro di questo campione in una cartuccia di estrazione in fase solida precondizione con un grammo di Assorbente e una capacità di sei millilitri. Eseguire il frazionamento, utilizzando circa tre volumi morti di ogni LUN di estrazione, e raccogliere una frazione per composizione LUN. Salvare le aliquote per l'analisi chimica e i biosagiamenti.

Rimuovere il solvente sotto vuoto, flusso di azoto o lyophilization e registrare il peso e la resa. Ricostituire la sostanza secca con i migliori solventi possibili. Calcolare la concentrazione di solvente per la soluzione stock, utilizzando la formula nel manoscritto testuale.

Riattivare il ceppo microbico di S.mutans UA 159 sull'agar del sangue e colturarlo in un mezzo di coltura liquida. Eseguire una diluizione da uno a 20 della coltura iniziale utilizzando lo stesso mezzo di coltura e incubarla fino a raggiungere la fase di crescita a metà log. Preparare l'inoculo con una popolazione definita in TYEG per i test antimicrobici e TYE con l'1% di saccarosio per i test del biofilm.

Per l'attività antimicrobica, definire la concentrazione del campione per l'analisi e aggiungerlo a una piastra da 96 porsi. Includere una serie di controlli in ogni lastra, come descritto nel manoscritto testuale. Utilizzando TYEG, regolare il volume a 100 microlitri, inoculare 100 microlitri di coltura microbica e incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Analizzare la crescita batterica in base alla torbidità mediante ispezione visiva dei pozzi. Inoculare un'aliquota della diluizione desiderata in specifiche piastre di agar in duplicati e incubare le piastre. Dopo l'incubazione, eseguire il conteggio delle colonie.

Pesare le perle di idrossiapatite nei microtubi e sterilizzarle. Quindi lavare le perline, usando il tampone di adsorbimento Ab.Aggiungere 500 microlitri di saliva nei microtubi per formare un film salivare e incubare a 37 gradi Celsius con 24 rotazioni al minuto per 40 minuti. Rimuovere il supernatante saliva e lavare le perline tre volte con Ab per prepararle per i saggi a valle.

Aggiungere 500 microlitri del campione o il controllo in ogni microtubo contenente perline con pellicolo salivare e incubarli a 24 rotazioni al minuto e 37 gradi Celsius per 30 minuti. Lavare le perline tre volte con Ab.Aggiungere 500 microlitri di coltura microbica a ciascun microtubo e incubare i tubi in condizioni simili per un'ora. Quindi lavare le celle non unite tre volte con ab buffer.

Resuspend ogni campione con un millilitro di buffer Ab e centicade a sette Watt per 30 secondi. Diluire in serie le aliquote di ogni sospensione, dieci volte, e placcarle su specifiche piastre di agar. Incubare le piastre per 48 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% e contare le colonie.

Per l'analisi dei dati, inserire i dati grezzi per i biosasay in un foglio di calcolo e calcolare il registro dell'inibizione della crescita microbica da parte di ciascun trattamento e la percentuale di log dell'inibizione della crescita microbica, rispetto al controllo. Correggere la densità ottica delle letture e calcolare la percentuale di inibizione della biomassa. Il profilo chimico dello screening biologico per la quantità di diterpeni di tipo Clerodane e flavonoidi glicosilati in tre varietà di estratti di C.sylvestris, vale a dire sylvestris, intermedio e lingua, sono mostrati qui.

Dopo l'analisi dei dati grezzi, quattro estratti hanno mostrato una risposta favorevole. I dati cromatografici di questi quattro estratti mostrano la presenza simultanea di diterpeni di tipo Clerodane e flavonoidi glicosilati. Inoltre, includono lo stesso bioma e varietà.

La percentuale calcolata di CFU delle cellule planctoniche trattate, la percentuale di biomassa dei biofilm trattati e la percentuale di CFU del biofilm trattato sono mostrate qui. Nessun estratto grezzo ha influenzato significativamente la rimozione delle cellule S.mutans aderenti al pellicolo salivare. L'adesione delle cellule di S.mutans alla matrice del glucano è stata indebolita da tre degli estratti grezzi.

Poiché ogni specie vegetale richiede metodi di analisi chimica ottimizzati e specifici, la migliore frazione di solvente e il metodo analitico devono essere selezionati da relazioni precedenti o definiti mediante progettazione sperimentale. È fondamentale preparare formulazioni con l'estratto grezzo e le frazioni più attive e testarle su modelli complessi per prevenire lo sviluppo di biofilm e cavità.