Name: Approccio sistematico per identificare nuove molecole antimicrobiche e antibiofilm dagli estratti e dalle frazioni delle piante per prevenire la carie dentale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Scopri un protocollo semplificato per identificare composti antimicrobici e antibiofilm da estratti vegetali contro Streptococcus mutans. Questo metodo aiuta a prevenire la carie dentale usando estrazione idroalcolica assistita da ultrasuoni.

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Esprimiamo la nostra gratitudine a Núcleo de Bioensaios, Biossíntese ed Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) dell'Istituto di Chimica dell'UNESP, Araraquara/SP per aver fornito i laboratori per la preparazione del materiale vegetale. Ringraziamo anche il Laboratorio di Microbiologia Applicata del Dipartimento di Materiali Dentali e Protesi, UNESP, Araraquara/SP. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione di ricerca della São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600-3 all'AJC) e da borse di studio più fondi generali (FAPESP #2017/07408-6 e FAPESP #2019/23175-7 alla SMR; #2011/21440-3 e #2012/21921-4 al PCPB). Il Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico in collaborazione con fapesp ha fornito ulteriore sostegno (INCT CNPq #465637/2014-0 e FAPESP #2014/50926–0 all'AJC).

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Le principali sfide legate al lavoro con estratti grezzi naturali comprendono la loro composizione complessa e le inadeguatezze dei classici studi di isolamento bioguidato. Sebbene questo processo sia lento, è efficace e ha portato a importanti risultati nella ricerca NP. Per razionalizzare, sono necessari studi basati sulla definizione delle priorità per razionalizzare. Pertanto, l'uso di moderni approcci di profilazione chimica per l'analisi del CE e della dereplicazione prima dell'isolamento è importante per caratteri...

I primi modelli di medicina utilizzati nelle società erano basati su prodotti naturali (NP). Da allora, gli esseri umani sono alla ricerca di nuove sostanze chimiche in natura che possono essere trasformate infarmaci 1. Questa ricerca ha causato un miglioramento continuo delle tecnologie e dei metodi per lo screening etnobotanico1,2,3. I PNP offrono una ricca fonte di sostanze strutturalmente diverse, con una vasta gamma di attività biologiche utili per lo sviluppo di terapie alternative o adiuvanti. Tuttavia, la matrice vegetale complessa intrinseca rende l'isolamento e l'identificazione dei composti attivi un compito impegnativo e dispendioso in termini di tempo4.
I farmaci o le formulazioni a base di PNP possono essere utilizzati per prevenire e/o trattare diverse condizioni che influenzano l'orale, compresa la carie dentale4. La carie dentale, una delle malattie croniche più diffuse a livello globale, deriva dall'interazione della dieta ricca di zucchero e dei biofilm microbici (placca dentale) formatisi sulla superficie dentale che porta alla demineralizzazione causata da acidi organici derivati dal metabolismo microbico e, se non trattati, porta alla perditadei denti 5,6. Sebbene altri microrganismi possano essere associati a7, Lo Streptococcus mutans è un batterio cariogenico critico perché acidogeno, acidurico e un generatore di matrici extracellulari. Questa specie codifica per esoenzimi multipli (ad esempio glicosiltransferasi o Gtfs) che usano il saccarosio come substrato8 per costruire la matrice extracellulare ricca di esopolisaccaridi, che sono un determinante della virulenza9. Inoltre, il fungo Candida albicans può aumentare la produzione di quella matrice extracellulare7. Sebbene il fluoruro, somministrato in varie modalità, rimanga la base per prevenire la carie dentale10, sono necessari nuovi approcci come coadiuvanti per aumentarne l'efficacia. Inoltre, le modalità anti-placca disponibili si basano sull'uso di agenti microbicidi ad ampio spettro (ad esempio, clorexidina)11. In alternativa, i PNP sono potenziali terapie per controllare i biofilm e prevenire la cariedentale 12,13.
L'ulteriore progresso nella scoperta di nuovi composti bioattivi dalle piante comprende misure o approcci necessari quali: i) l'uso di protocolli affidabili e riproducibili per il campionamento, considerando che le piante mostrano spesso variabilità intraspecifica; — la preparazione di estratti completi e delle rispettive frazioni su piccola scala; — la caratterizzazione e/o la dereplicazione dei loro profili chimici ha ritenuto che l'acquisizione di dati multidimensionali come GC-MS, LC-DAD-MS o NMR, per esempio; — l'uso di modelli validi e ad alto rendimento per valutare la bioattività; — la selezione di potenziali nuovi riscontri basati sull'analisi multivariata dei dati o su altri strumenti statistici; — effettuare l'isolamento e la purificazione dei composti mirati o dei candidati promettenti; e vii) la convalida delle attività biologiche corrispondenti utilizzando i composti isolati2,14.
La dereplicazione è il processo di identificazione rapida di composti noti nell'estratto grezzo e consente di differenziare nuovi composti da quelli che sono già stati studiati. Inoltre, questo processo previene l'isolamento quando la bioattività è già stata descritta per alcuni composti ed è particolarmente utile rilevare "battitori frequenti". È stato utilizzato in diversi flussi di lavoro non mirati che vanno dall'identificazione dei composti principali o all'accelerazione del frazionamento guidato dall'attività fino alla profilazione chimica delle raccolte di estratti. Può essere completamente integrato con studi metabolomici per la profilazione chimica non mirata di CE o l'identificazione mirata dei metaboliti. Tutto ciò alla fine porta a dare priorità alle estrazioni prima delle proceduredi isolamento 1,15,16,17.
Pertanto, nel presente manoscritto, descriviamo un approccio sistematico per identificare molecole antimicrobiche e antibiofilm da estratti e frazioni vegetali. Esso comprende quattro fasi multidisciplinari: (1) raccolta di materiale vegetale; 2) preparazione di estratti grezzi (CE) e frazioni (MCE), seguita dalla loro analisi del profilo chimico; 3) biosasay; e (4) analisi dei dati biologici e chimici(figura 1). Presentiamo così il protocollo sviluppato per analizzare le attività antimicrobiche e antibiofilmali degli estratti e frazioni di Casearia sylvestris contro Streptococcus mutans e Candida albicans13,nonché le procedure per la caratterizzazione fitochimica e l'analisi dei dati. Per semplicità, l'obiettivo qui è dimostrare l'approccio per lo screening dei composti naturali usando il batterio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso dell'approccio sistematico per identificare molecole attive da estratti e frazioni vegetali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61773/61773fig01v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Micropiastre a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>Fondo piatto</td><td></td></tr><tr><td>Carbone attivo</td><td>LABSYNTH</td><td>Fase</td><td></td>di pulizia e/o frazionamento</tr><tr><td>Mulino analitico</td><td>Ika LabortechniK</td><td>Modello A11 Base</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di agar per sangue</td><td>Laborclin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna cromatografica C18</td><td>Phenomenex Kinetex</td><td>150 &volte; 2,1 mm, 2,6 &; m, 100&Acirc;</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Soluzione</td><td></td>per veicoli</tr><tr><td>Lettore di piastre ELISA</td><td>Biochrom Ez</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>J. T. Baker</td><td>Per le fasi di estrazione e frazionamento e la composizione</td><td></td>della fase mobile</tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Soluzione</td><td></td>per veicoli</tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>J. T. Baker</td><td>Fase</td><td></td>di frazionamento</tr><tr><td>GraphPad Software</td><td>La Jolla</td><td>GraphPad Prism7</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>J. T. Baker</td><td>Fase di</td><td></td>frazionamento</tr><tr><td>Incubatore</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>J. T. Baker</td><td>Per la fase</td><td></td>di estrazione</tr><tr><td>Liofilizzatore (un liofilizzatore)</td><td>Savant</td><td>Modulyo</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Millipore</td><td>LAC</td><td>0.22 &; m x 13 mm</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Quimis</td><td>Modello G816&thinsp; Cartuccia di</td> estrazione in fase solida in poliammide M20 <td></td></tr><tr><td></td><td>Macherey-Nagel</td><td>Fase di pulizia e/o frazionamento</td><td></td></tr><tr><td>Gel di silice</td><td>Merck</td><td>40&ndash; 63&sottile; &mu; m, 60&magre; &acirc;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Synth</td><td>0,89% in acqua</td><td></td></tr><tr><td>Cartucce di estrazione in fase solida (SPE)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>Fase</td><td></td>di pulizia e/o frazionamento</tr><tr><td>Triptone</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UHPLC-DAD</td><td>Dionex</td><td>Ultimate 3000 RS</td><td></td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>UNIQUE</td><td>Modello USC 2800</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

approccio sistematico per identificare nuove molecole antimicrobiche e antibiofilm dagli estratti e dalle frazioni delle piante per prevenire la carie dentale

Systematic Approach to Identify Novel Antimicrobial and Antibiofilm Molecules from Plants' Extracts and Fractions to Prevent Dental Caries

I prodotti naturali forniscono sostanze strutturalmente diverse, con una miriade di attività biologiche. Tuttavia, l'identificazione e l'isolamento dei composti attivi dalle piante sono impegnativi a causa della complessa matrice vegetale e delle lunghe procedure di isolamento e identificazione. Pertanto, viene presentato un approccio graduale per lo screening dei composti naturali dalle piante, incluso l'isolamento e l'identificazione di molecole potenzialmente attive. Comprende la raccolta del materiale vegetale; preparazione e frazionamento di estratti grezzi; approcci cromatografici e spettrometrici (UHPLC-DAD-HRMS e NMR) per l'analisi e l'identificazione dei composti; test biometrici (attività antimicrobiche e antibiofilm; "forza di adesione" batterica al pellicolo salivare e matrice di glucano iniziale trattata con trattamenti selezionati); analisi dei dati. Il modello è semplice, riproducibile e consente lo screening ad alta produttività di più composti, concentrazioni e fasi di trattamento che possono essere controllati in modo coerente. I dati ottenuti forniscono le basi per studi futuri, tra cui formulazioni con gli estratti e/o frazioni più attivi, isolamento delle molecole, modellazione di molecole a target specifici in cellule microbiche e biofilm. Ad esempio, un obiettivo per controllare il biofilm cariogenico è quello di inibire l'attività dello Streptococcus mutans glucosyltransferasi che sintetizzano i glucani della matrice extracellulare. L'inibizione di questi enzimi impedisce l'accumulo di biofilm, diminuendone la virulenza.

Forniamo un esempio di utilizzo di un approccio sistematico per migliorare l'attività biologica degli estratti vegetali e delle frazioni per identificare molecole potenzialmente attive per possibili nuove terapie anti-carie: attività antimicrobiche e antibiofilm degli estratti di Casearia sylvestris da distinti biomi brasiliani contro Streptococcus mutans e Candida albicans13.
Priorità bassa Interazioni complesse tra specif...

I prodotti naturali rappresentano punti di partenza promettenti per lo sviluppo di nuovi farmaci e agenti terapeutici. Tuttavia, a causa dell'elevata diversità chimica, trovare nuovi composti terapeutici dalle piante è un compito impegnativo e dispendioso in termini di tempo. Descriviamo un approccio semplificato per identificare molecole antimicrobiche e antibiofilm da estratti e frazioni vegetali.

Approccio sistematico per identificare nuove molecole antimicrobiche e antibiofilm dagli estratti e dalle frazioni delle piante per prevenire la carie dentale

Natural products provide structurally different substances, with a myriad of biological activities. However, the identification and isolation of active ...

Il protocollo presentato viene utilizzato per lo screening e l'analisi corretti dei candidati bioattivi nei prodotti naturali per controllare i biofilm orali. Può anche essere adattato per applicazioni in altri campi di ricerca sul biofilm. Questo metodo di screening e analisi della maggior parte degli amidi consente di rimuovere contemporaneamente i componenti bioattivi.La carie dentale è una dieta biofilm derivata, altamente prevalente, malattia cronica. Questo protocollo può aiutare a identificare i prodotti naturali per controllare i biofilm e, di conseguenza, la carie dentale. Iniziare preparando il solvente da estrazione con una miscela idroalcolica.Campionare concentrazioni tra 50 e 100 milligrammi per millilitro del solvente da estrazione ed eseguire estrazioni assistite da ultrasuoni di 15 minuti in microtubi. Ripetere l'estrazione tre volte. Dopo ogni fase di estrazione, centrifugare il campione per decapare il residuo solido e rimuovere il supernatante.Unire i supernaganti di ogni fase di estrazione e filtrarli. Salvare le aliquote per l'analisi chimica e i biosatti. Per il frazionamento, diluire il campione di estratto grezzo per ottenere una soluzione di 100 milligrammi per millilitro, utilizzando il solvente da estrazione iniziale.Quindi, trasferire un millilitro di questo campione in una cartuccia di estrazione in fase solida precondizione con un grammo di Assorbente e una capacità di sei millilitri. Eseguire il frazionamento, utilizzando circa tre volumi morti di ogni LUN di estrazione, e raccogliere una frazione per composizione LUN. Salvare le aliquote per l'analisi chimica e i biosagiamenti.Rimuovere il solvente sotto vuoto, flusso di azoto o lyophilization e registrare il peso e la resa. Ricostituire la sostanza secca con i migliori solventi possibili. Calcolare la concentrazione di solvente per la soluzione stock, utilizzando la formula nel manoscritto testuale.Riattivare il ceppo microbico di S.mutans UA 159 sull'agar del sangue e colturarlo in un mezzo di coltura liquida. Eseguire una diluizione da uno a 20 della coltura iniziale utilizzando lo stesso mezzo di coltura e incubarla fino a raggiungere la fase di crescita a metà log. Preparare l'inoculo con una popolazione definita in TYEG per i test antimicrobici e TYE con l'1% di saccarosio per i test del biofilm.Per l'attività antimicrobica, definire la concentrazione del campione per l'analisi e aggiungerlo a una piastra da 96 porsi. Includere una serie di controlli in ogni lastra, come descritto nel manoscritto testuale. Utilizzando TYEG, regolare il volume a 100 microlitri, inoculare 100 microlitri di coltura microbica e incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.Analizzare la crescita batterica in base alla torbidità mediante ispezione visiva dei pozzi. Inoculare un'aliquota della diluizione desiderata in specifiche piastre di agar in duplicati e incubare le piastre. Dopo l'incubazione, eseguire il conteggio delle colonie.Pesare le perle di idrossiapatite nei microtubi e sterilizzarle. Quindi lavare le perline, usando il tampone di adsorbimento Ab.Aggiungere 500 microlitri di saliva nei microtubi per formare un film salivare e incubare a 37 gradi Celsius con 24 rotazioni al minuto per 40 minuti. Rimuovere il supernatante saliva e lavare le perline tre volte con Ab per prepararle per i saggi a valle.Aggiungere 500 microlitri del campione o il controllo in ogni microtubo contenente perline con pellicolo salivare e incubarli a 24 rotazioni al minuto e 37 gradi Celsius per 30 minuti. Lavare le perline tre volte con Ab.Aggiungere 500 microlitri di coltura microbica a ciascun microtubo e incubare i tubi in condizioni simili per un'ora. Quindi lavare le celle non unite tre volte con ab buffer.Resuspend ogni campione con un millilitro di buffer Ab e centicade a sette Watt per 30 secondi. Diluire in serie le aliquote di ogni sospensione, dieci volte, e placcarle su specifiche piastre di agar. Incubare le piastre per 48 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% e contare le colonie.Per l'analisi dei dati, inserire i dati grezzi per i biosasay in un foglio di calcolo e calcolare il registro dell'inibizione della crescita microbica da parte di ciascun trattamento e la percentuale di log dell'inibizione della crescita microbica, rispetto al controllo. Correggere la densità ottica delle letture e calcolare la percentuale di inibizione della biomassa. Il profilo chimico dello screening biologico per la quantità di diterpeni di tipo Clerodane e flavonoidi glicosilati in tre varietà di estratti di C.sylvestris, vale a dire sylvestris, intermedio e lingua, sono mostrati qui.Dopo l'analisi dei dati grezzi, quattro estratti hanno mostrato una risposta favorevole. I dati cromatografici di questi quattro estratti mostrano la presenza simultanea di diterpeni di tipo Clerodane e flavonoidi glicosilati. Inoltre, includono lo stesso bioma e varietà.La percentuale calcolata di CFU delle cellule planctoniche trattate, la percentuale di biomassa dei biofilm trattati e la percentuale di CFU del biofilm trattato sono mostrate qui. Nessun estratto grezzo ha influenzato significativamente la rimozione delle cellule S.mutans aderenti al pellicolo salivare. L'adesione delle cellule di S.mutans alla matrice del glucano è stata indebolita da tre degli estratti grezzi.Poiché ogni specie vegetale richiede metodi di analisi chimica ottimizzati e specifici, la migliore frazione di solvente e il metodo analitico devono essere selezionati da relazioni precedenti o definiti mediante progettazione sperimentale. È fondamentale preparare formulazioni con l'estratto grezzo e le frazioni più attive e testarle su modelli complessi per prevenire lo sviluppo di biofilm e cavità.

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