Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

I protocolli qui descritti, dovrebbero facilitare futuri studi sui difetti oligodendrogliali, nella patogenesi della neurodegenerazione. Questo è un metodo migliorato che può essere utilizzato per generare cellule funzionali di oligodendrociti umani in sole tre o quattro settimane e stabilire un sistema di co-coltura per modellare le connessioni neuronali degli oligodendrociti. Il protocollo può essere utilizzato per studiare non solo l'Alzheimer, ma qualsiasi altro aspetto associato alla malattia delle interazioni neuronali con gli oligodendrociti.

Per iniziare, piastrate circa un milione di cellule HEK293T in ogni fiaschetta T75 per raggiungere una confluenza del 40%, quindi trasfettatele con plasmidi che esprimono NGN2 inducibile dalla tetraciclina e gene transattivatore della tetraciclina resistente alla puromicina, insieme ai tre plasmidi helper. Usa PEI per la trasfezione. Cambiare il supporto dopo 16 ore.

Harvest ha rilasciato particelle virali raccogliendo terreni di coltura ogni giorno e sostituendoli con terreni freschi per tre giorni. Raggruppare il terreno raccolto per la purificazione, quindi filtrare il virus attraverso un filtro da 0,22 micrometri e centrifugare a 49.000 volte G per 90 minuti. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet nel volume appropriato di glucosio PBS.

Utilizzare cellule ES umane H1 disponibili in commercio per eseguire l'induzione neuronale. Colture delle cellule su piastre rivestite con soluzione di matrice extracellulare a 6 pozzetti con terreno di mantenimento ESL e incubazione delle piastre a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Due giorni prima dell'induzione del differenziamento, staccare le cellule ES aggiungendo un millilitro di soluzione di distacco cellulare e incubando a temperatura ambiente per 10 minuti.

Trasferire le cellule in una provetta, quindi lavare il pozzetto con due millilitri di terreno e aggiungerlo alla stessa provetta. Centrifugare le celle a 300 volte G per cinque minuti. Quindi risospendere il pellet in un terreno e placcare le celle su piastre a 6 pozzetti rivestite in matrice alla densità di sede di una volta per 10 per la quinta cella per pozzetto.

Il giorno successivo, aggiungere lentivirus, che esprimono NGN2 più puro. R, e transattivatore di tetraciclina insieme a polibrene in terreno di mantenimento delle cellule ES fresche. Il giorno zero, aggiungere due microgrammi per millilitro di doxiciclina in terreno DMEM/F-12 integrato con N2 e senza morfogeni.

Il primo giorno, aggiungere la puromicina in DMEM/F-12 fresco, oltre a N2 e doxiciclina alla concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Selezionare le cellule trasdotte in puromicina per almeno 24 ore. Il secondo giorno, staccare i neuroni differenzianti con una soluzione di distacco cellulare e ripiastrirli su piastre a 24 pozzetti rivestite con una soluzione di matrice.

Mantenerli in terreno MBA B27 senza doxiciclina. Coltura di neuroni indotti puri sulle piastre, rivestiti con soluzioni basate su matrice extracellulare. Per eseguire la generazione di cellule progenitrici neurali, coltivare cellule ES umane H1 e transdifferenziarle in cellule progenitrici neurali, come descritto nel manoscritto del testo.

Il primo giorno negativo, seminare da 0,5 a un milione di cellule in un terreno di mantenimento delle cellule ES in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita con una soluzione a matrice ridotta con fattore di crescita. Il giorno zero, trattare le cellule per 24 ore con un terreno di mantenimento delle cellule ES integrato con DMSO al 2%. Dal primo al sesto giorno, sostituire l'intero supporto con un mezzo di induzione neurale caldo contenente alcuni inibitori aggiuntivi da un kit commerciale.

Il settimo giorno, far passare le NPC utilizzando una soluzione di distacco cellulare e piastrelle a una densità di seduta di una o due volte 10 fino alla quinta cellula per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Valutare l'efficienza di differenziazione mediante colorazione immunoistochimica per l'assenza di marcatori di pluripotenza e la presenza di marcatori NPC. Per generare le cellule precursori degli oligodendrociti, placcare le NPC in un mezzo di induzione neurale caldo con alcuni inibitori aggiunti da un kit commerciale.

L'ottavo giorno, preparare una soluzione di DMSO all'1% nel mezzo di differenziazione OPC e trattare gli NPC placcati per 24 ore. Il nono giorno, sostituire il terreno con un terreno di differenziazione OPC fresco senza DMSO, quindi alimentare le cellule a giorni alterni fino al giorno 15. Se le celle raggiungono la confluenza prima del giorno 15, farle passare alla densità di seduta di una o due volte 10 alla quinta cella per pozzetto.

Il giorno 14, piastra gli OPC in mezzo di differenziazione OPC a una densità di una o due volte 10 al quinto pozzetto, in una piastra a 24 pozzetti. Testare le cellule per la presenza di marcatori specifici OPC mediante colorazione IHC o qPCR e per l'assenza di marcatori NPC. Il giorno 15, sostituire il terreno con il terreno di maturazione OL.

Cambia il mezzo a giorni alterni o tutti i giorni. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, dividerle in un rapporto da uno a tre per un massimo di due passaggi o fino a quando la divisione cellulare non rallenta notevolmente. Se gli OPC si dividono troppo velocemente e raggiungono la confluenza in meno di tre giorni, aggiungere Ara-C a una concentrazione da due a cinque micromolari per uno o tre giorni.

Il giorno 14, piastra le IOPC a una densità di una volta 10 per la quinta cellula per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti in terreno di differenziazione OPC. Il giorno successivo, staccare i neuroni umani indotti con una soluzione di distacco cellulare. Aggiungere neuroni alle OPC in coltura, placcando alla densità di seduta di due volte 10 alla quinta cellula per pozzetto.

Utilizzare un terreno di co-coltura contenente terreno neurobasale A, integratore di B27 al 2% e 100 nanogrammi per millilitro di triiodotironina T3. Cambia il mezzo il giorno successivo e poi a giorni alterni. Se gli OPC proliferano troppo velocemente e raggiungono la confluenza in meno di tre giorni, aggiungere da due a cinque micromolari di Ara-C.

È importante che le cellule staminali pluripotenti umane di partenza mostrino un alto grado di pluripotenza per la generazione di successo di neuroni indotti, o OPC e oligodendrociti. Pertanto, le cellule devono essere colorate per marcatori specifici, come OCT-4 e SOX2, prima di iniziare uno dei protocolli di induzione. Le cellule H1 umane sono state utilizzate per ottenere neuroni eccitatori indotti del prosencefalo.

I neuroni puri in coltura hanno iniziato a esprimere sinapsi in uno al giorno 14-16. Gli IOPC sono stati generati in due settimane e gli oligodendrociti maturi in quattro o cinque settimane. Il trattamento con DMSO ha arricchito il numero di cellule nella fase iniziale G1 per una migliore integrazione dei segnali.

Specifici marcatori OPC sono stati rilevati già due settimane dopo la placcatura delle cellule ES H1. La popolazione IOPC a due settimane era abbastanza omogenea, con oltre il 95% delle cellule positive per la colorazione 04 e un alto livello di immunoreattività per altri marcatori. Dopo l'inizio della maturazione degli oligodendrociti, sono stati rilevati marcatori specifici degli oligodendrociti a partire dal giorno 28.

Le densità ideali di placcatura per i neuroni indotti e le IOPC devono essere determinate con una serie di titolazioni del numero di cellule per ottenere una corretta differenziazione. Dopo quattro settimane, in co-colture, gli IOPC dovrebbero essere adeguatamente differenziati in oligodendrociti positivi per marcatori specifici come la MBP. Questo sistema di co-coltura può aumentare in modo robusto il numero di sinapsi, indicando che le IOPC forniscono un supporto neuronale attraverso il contatto fisico o il rilascio di fattori trofici.

Questa procedura descritta può essere ulteriormente sofisticata aggiungendo diversi tipi di cellule cerebrali. Ad esempio, le cellule staminali hanno derivato astrociti umani per modellare nuovi aspetti delle interazioni neuroni gliali in salute e malattia.