Profilazione cellulare ad alto rendimento di composti di degradazione proteica mirati utilizzando linee cellulari HiBiT CRISPR
November 9th, 2020
Questo protocollo descrive la rilevazione luminescente quantitativa della cinetica di degradazione delle proteine in cellule viventi che sono state ingegnerizzate utilizzando CRISPR / Cas9 per esprimere il tag di rilevamento delle proteine endogene prive di anticorpi fuso a una proteina bersaglio. Sono incluse istruzioni dettagliate per calcolare e ottenere parametri quantitativi di degradazione, velocità, Dmax, DC 50 e Dmax50.
Questo approccio consente il monitoraggio cellulare della degradazione delle proteine e lo screening rapido dei composti degradatori. La dinamica della degradazione può essere monitorata in un contesto cellulare in modo altamente sensibile e quantitativo, consentendo una determinazione accurata dei parametri chiave di degradazione. Questi metodi consentono la profilazione HTS dell'attività del composto degradatore, consentendo il triage nella fase iniziale di scoperta terapeutica.
Forniscono inoltre informazioni per chiunque voglia studiare la modulazione dei livelli target endogeni, sia in aumento che in diminuzione. A dimostrare la procedura sarà Celia Bisbach, una ricercatrice del mio laboratorio. Iniziare preparando e impiattando le cellule aderenti o in sospensione dei mammiferi.
Regolare la densità cellulare a 2,22 volte 10 per 5 cellule per millilitro e distribuirle in piastre con un minimo di tre pozzetti per condizione sperimentale e di controllo. Preparare piastre PROTAC diluite in serie, o piastre per composti di degradazione, a una concentrazione di 1000x in DMSO al 100%. Quindi diluirlo a 10 volte la concentrazione finale nel terreno di coltura cellulare.
Aggiungere un volume uguale di DMSO al mezzo per creare un controllo DMSO non composto. Aggiungere la quantità appropriata di composto 10x o soluzione di controllo alle cellule della piastra e incubare le piastre a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Per misurare il segnale luminescente del punto finale, preparare 2 reagenti per la rilevazione litica aggiungendo 20 microlitri di substrato litico e 10 microlitri di proteina LgBiT per ogni millilitro di tampone litico.
Preparare una quantità di reagente sufficiente per l'analisi di tutti i pozzetti, compreso il volume extra per tenere conto dell'errore di pipettaggio. Aggiungere il reagente di rivelazione litica preparato alle cellule e mescolare la piastra su un miscelatore a vortice per micropiastre per 10-20 minuti a 350 giri/min. Misura la luminescenza su un luminometro in grado di leggere una piastra da 96 o 384 pozzetti.
Se si utilizza il multiplexing della vitalità cellulare, farlo prima dell'aggiunta del reagente litico. Da 30 a 40 minuti prima della misurazione dell'endpoint desiderato, preparare una soluzione di reagente per la rilevazione della vitalità cellulare 6x aggiungendo 10 microlitri di substrato a due millilitri del tampone del saggio. Aggiungere il reagente preparato ai pozzetti e mescolare brevemente su un miscelatore a vortice per micropiastre.
Quindi incubare la piastra per 30 minuti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Al punto finale desiderato, misurare la fluorescenza su uno strumento in grado di leggere la fluorescenza in formato 96 o 384 pozzetti. Preparare 2x reagente litico come descritto in precedenza.
Quindi aggiungere il reagente ai pozzetti e mescolare la piastra su un miscelatore a vortice per micropiastre per 10-20 minuti. Dopo la miscelazione, utilizzare un luminometro per misurare la luminescenza. Per dimostrare l'analisi della degradazione litica a singolo endpoint di concentrazione, diverse proteine bersaglio CDK sono state marcate endogenamente con HiBiT e trattate con PROTAC TL12-186 a base di pan chinasi cereblon.
Il livello della proteina CDK è stato misurato in diversi punti temporali ed è stata determinata la RLU frazionaria. Per capire come le proteine CDK si confrontano direttamente tra loro in termini di perdita proteica, le RLU frazionarie sono state calcolate come percentuale totale di degradazione. È stata eseguita un'analisi di degradazione cinetica marcando endogenamente le proteine membri della famiglia BET con cellule HiBiT e HEK293 che esprimono stabilmente la proteina LgBiT.
Le cellule sono state quindi trattate con tre diverse concentrazioni dei PROTAC pan-BET. Il dBET6 basato su cereblon e l'ARV-771 basato su VHL. Di seguito sono mostrati i profili di degradazione cinetica dose-risposta delle cellule Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat che esprimono stabilmente la proteina LgBiT trattate con quattro diversi composti molecolari di colla.
Si osservano differenze significative nella risposta alla degradazione tra i composti, così come tra le serie di concentrazioni. Per valutare quantitativamente la degradazione e l'ordine di classificazione dei composti, i profili dose-risposta sono stati utilizzati per calcolare i parametri chiave di degradazione, tra cui il tasso di degradazione, il massimo di degradazione e i valori di Dmax50. I saggi multiplex di vitalità cellulare non hanno mostrato alcuna perdita di vitalità cellulare per le concentrazioni testate.
I passaggi più importanti di questo protocollo sono la determinazione dell'RLU frazionario o della percentuale di degradazione mediante normalizzazione al controllo DMSO. Seguendo questo protocollo, si potrebbe eseguire un test fenotipico per capire come la perdita di una particolare proteina può influire sulla salute o sulla funzione cellulare. Inoltre, queste linee cellulari HiBiT possono essere utilizzate anche per studiare le interazioni proteiche o il legame di piccole molecole utilizzando la tecnologia NanoBRET.
Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per rilevare quantitativamente la cinetica di degradazione delle proteine in cellule viventi utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9. Fornisce istruzioni dettagliate per calcolare i parametri di degradazione come la velocità e Dmax.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Biologia cellulare
- Degradazione delle proteine
- Tecnologia CRISPR/Cas9
Sfondo
- Comprendere la degradazione delle proteine è cruciale per la salute cellulare.
- CRISPR/Cas9 consente modifiche genetiche precise.
- Il monitoraggio della degradazione può aiutare nella scoperta terapeutica.
- I metodi quantitativi migliorano l'accuratezza degli studi sulla degradazione.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo per monitorare la degradazione delle proteine in cellule vive.
- Consentire lo screening ad alto rendimento di composti degradanti.
- Fornire informazioni sulla modulazione dei livelli di proteine endogene.
Metodi utilizzati
- Preparazione e semina di cellule di mammifero a densità specifiche.
- Diluizione seriale di composti PROTAC per il test.
- Utilizzo di reagenti di rilevamento luminescente per misurare la degradazione.
- Calcolo dei parametri di degradazione dai dati di luminescenza.
Risultati principali
- Monitoraggio riuscito della cinetica di degradazione delle proteine in cellule vive.
- Identificazione di differenze significative nelle risposte di degradazione tra i composti.
- Valutazione quantitativa dei tassi di degradazione e dei valori massimi di degradazione.
- Nessuna perdita di vitalità cellulare osservata durante gli esperimenti.
Conclusioni
- Questo protocollo facilita lo studio della dinamica di degradazione delle proteine.
- Può essere applicato per valutare l'impatto della perdita di proteine sulle funzioni cellulari.
- Le linee cellulari marcate HiBiT sono utili per studiare le interazioni proteiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative, high-throughput assessment of targeted protein degradation in physiologically relevant cellular contexts, supporting early triage of degrader compounds. By maintaining endogenous expression and regulation of target proteins, it provides predictive confidence in lead optimization and reduces mechanistic ambiguity in discovery pipelines. The approach directly informs go/no-go decisions by linking compound-induced target degradation to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of target protein loss in native cellular environments.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying degradation kinetics and potency under physiological regulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating degradation rate, Dmax, and DC50 parameters for lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: CRISPR-engineered HiBiT cell lines provide standardized, reproducible systems for luminescent readout of target degradation.
- Multiplexing Capability: Compatible with cell viability assays to distinguish specific target effects from cytotoxicity during screening.
- Scalability: Luminescent signal detection in 96- or 384-well formats enables high-throughput profiling of degrader compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains endogenous protein expression and regulation, improving relevance to in vivo disease models.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of target degradation with functional cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive Confidence: Quantitative degradation profiling reduces late-stage failure risk by confirming target engagement in relevant cellular backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, providing degradation-competent cellular systems for compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time or endpoint measurement of target protein degradation in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (rate, Dmax, DC50) for high-throughput evaluation of degrader compound libraries.
- Analytics: Generates normalized degradation metrics that allow cross-compound comparison and rank-ordering based on target engagement.
- Translational Research: Connects target degradation to functional outcomes via multiplexed viability assays, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: HiBiT-tagged cell lines serve as reusable assets across multiple projects targeting different proteins or degradation mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation, reduces mechanistic ambiguity, and enables functional target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization, reproducibility, and scalability across screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhances capital efficiency, and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of degrader leads based on quantitative degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 genome editing and clonal cell line development.
- Dependent on luminescent plate readers capable of 96- or 384-well format detection.
- Necessitates standardization of cell plating density and reagent preparation across wells.
- Adaptation considerations include varying endogenous expression levels and subcellular localization of target proteins.
- Practical limitations include signal dynamic range constraints in highly abundant or rapidly turning over target proteins.
