Analisi del repertorio immunitario del recettore delle cellule T e B utilizzando il sequenziamento di nuova generazione
12 gennaio 2021
L'attuale protocollo descrive un metodo per l'isolamento del DNA da campioni di sangue e biopsie intestinali, generazione di librerie PCR TCRβ e IGH per il sequenziamento di nuova generazione, le prestazioni di una corsa NGS e l'analisi dei dati di base.
Questo metodo consente l'esplorazione di specifiche cellule T e B a livello nucleotidico o amminoacido e può quindi identificare cambiamenti dinamici nelle popolazioni di linfociti e parametri di diversità in diversi disturbi. Il vantaggio del sequenziamento di nuova generazione è la capacità di identificare cloni di cellule T o B unici e rintracciarli in diversi siti anatomici o in individui diversi. Ciò ha il potenziale per identificare nuovi biomarcatori in diverse malattie.
A dimostrare questa procedura sarà Naomi Salamon, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Inizia eseguendo la digestione e la llisi cellulare delle biopsie intestinali. Recupera le biopsie intestinali appena raccolte o conservate a -20 o a -80 gradi Celsius.
Se si utilizzano biopsie congelate, scongelarle sul ghiaccio. Aggiungere 600 microlitri di soluzione di lysis nucleica a un tubo sterile a microcentrifugo da 1,7 millilitri, refrigerato sul ghiaccio. Quindi posizionare una biopsia nel tubo e incubarla a 65 gradi Celsius per 15-30 minuti.
Aggiungere 17,5 microlitri di proteinasi K da 20 milligrammi per millilitro e incubare il tubo durante la notte a 55 gradi Celsius, con un delicato scuotimento. Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti. Per l'isolamento del DNA dal sangue, scuotere delicatamente il tubo fino a quando non viene accuratamente miscelato.
Quindi trasferire il sangue in un tubo di centrifuga sterile da 15 millilitri contenente nove millilitri di soluzione di lisi cellulare. Invertire il tubo più volte durante un periodo di incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifuga a 600g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi scartare il più supernatante possibile senza disturbare il pellet bianco visibile. Vortice vigorosamente il tubo per 15 secondi fino a quando non viene completamente rimescolato. Aggiungere tre millilitri di soluzione dilisi nucleica e pipetta più volte, causando la viscosità della soluzione.
Aggiungere il tampone di precipitazione proteica al campione. Quindi vortice vigorosamente per 20 secondi e incubarlo sul ghiaccio per cinque minuti. Centrifuga a 16.000g per quattro minuti per formare un pellet stretto contenente le proteine precipitate.
Trasferire con cura il supernatante senza disturbare il pellet in un nuovo tubo da 1,7 millilitri. Aggiungere un millilitro di 2-propanolo al tubo contenente il supernatante e mescolarlo delicatamente invertendo. Il DNA dovrebbe diventare visibile come una sostanza bianca fluttuante.
Centrifugare a 16.000 volte g per un minuto e rimuovere completamente il supernatante. Aggiungere un millilitro di etanolo appena preparato al 70% e invertire il tubo più volte. Centrifugarlo a 16.000 g per un minuto a temperatura ambiente.
Quindi scartare con cura il supernatante. Ripetere il lavaggio dell'etanolo. Quindi lasciare asciugare il pellet di DNA per 10-15 minuti.
Aggiungere 50 microlitri di acqua ultra pura al DNA ed eseguire la quantificazione del DNA come descritto nel manoscritto testuale. Usa 150 nanogrammi di DNA per preparare la libreria al sequenziamento. Posizionare pipette e punte nella cappa con luce UV per 15 minuti per abbattere il DNA residuo.
Nel frattempo, consentire ai diversi tubi indice e dna polimerasi di scongelarsi sul ghiaccio. In una cappa biologica, aggiungere 45 microlitri dai diversi tubi indice ai tubi PCR, facendo attenzione ad evitare la contaminazione incrociata. Quindi aggiungere 0,2 microlitri della DNA polimerasi e cinque microlitri del DNA preparato nei tubi PCR.
Eseguire PCR utilizzando un programma preimpostato secondo le istruzioni del produttore. Usa perline magnetiche per la rimozione di primer, nucleotidi ed enzimi in eccesso. Riscaldare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 minuti e preparare abbastanza etanolo fresco all'80% per 400 microlitri per campione.
Aggiungere le perline a ciascun tubo PCR e mescolare pipettando 10 volte. Incubare i tubi per 10 minuti a temperatura ambiente. Posizionare il campione misto sul supporto magnetico per cinque minuti.
Quindi aspirare il liquido limpido e scartare. Aspirare il liquido rimanente utilizzando una punta da 10 microliter. Aggiungere 200 microlitri di 80%etanolo a ciascun campione e incubare per 30 secondi.
Aspira 195 microlitri di etanolo e scarta. Quindi aspirare il liquido rimanente utilizzando una punta da 10 microliter. Ripetere il lavaggio dell'etanolo.
Quindi aprire i tappi dei tubi e lasciarli asciugare all'aria per cinque minuti. Dopo cinque minuti, rimuovere i campioni dal supporto magnetico e aggiungere 25 microlitri di tampone di eluizione. Mescolare con pipettazione fino a omogenea e incubare a temperatura ambiente per due minuti.
Posizionare i tubi sul supporto magnetico per cinque minuti. Quindi trasferire 22 microlitri su un nuovo tubo PCR e misurare la concentrazione di DNA. Quantificare l'amplicon come descritto nel manoscritto testuale.
Dopo aver calcolato la concentrazione finale del DNA e la dimensione in coppie di basi del picco del prodotto, preparare un nuovo mix di diluizione per ogni campione e trasferirvi due microlitri in un nuovo mix di pool. Preparare una soluzione fresca di idrossido di sodio normale 0,2 e aggiungere 10 microlitri alla libreria diluita. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per denaturare il DNA a doppio filamento.
Quindi aggiungere 980 microlitri di tampone pre-refrigerato dal kit al tubo contenente DNA e vortice brevemente. Caricare 600 microlitri della libreria finale sulla cartuccia designata e posizionare i campioni nella macchina. Per eseguire l'analisi di sequenziamento, scaricare le metriche di sequenziamento dal sequencer e verificare che i dati si trovano all'interno degli intervalli appropriati.
Ripetere l'esecuzione per i campioni che non soddisfano i criteri. Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire un'analisi di base di campioni rappresentativi di sangue autologo e rettale di un paziente con carenza del recettore IL10 e una storia di grave IBD ad esordio infantile. I campioni sono stati analizzati sia per il repertorio TCR-beta che per quello IGH.
Tutti i cloni possono essere identificati dalla loro sequenza unica a livello nucleotidico o amminoacido. Queste sequenze possono essere confrontate tra diversi pazienti alla ricerca di cloni condivisi o nello stesso paziente tra diversi siti anatomici. I cinque cloni più frequenti per ogni campione sono mostrati qui.
Le immagini TreeMap sono state generate per un'ampia panoramica del repertorio. Ogni quadrato colorato rappresenta un clone diverso e la dimensione è correlata alla sua frequenza. Queste immagini TreeMap dimostrano l'espansione clonale nel repertorio intestinale IGH.
Al contrario, nel repertorio TCR-beta, si osserva una marcata espansione clonale nel sangue rispetto all'intestino autologo. A livello genico, NGS fornisce informazioni sull'uso di V, D e J a livello di gene, famiglia o allele. Inoltre, combinazioni VDJ specifiche possono essere dedotte dai dati per i repertori TCR-beta e IGH, rivelando modelli di utilizzo genico differenziale in varie condizioni.
Questo protocollo può essere applicato sia sul DNA che sull'RNA e può essere utilizzato per generare repertori TCR-alfa, TCR-gamma e IGL. È anche compatibile con altri organi dopo lievi modifiche alla digestione.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento del DNA da campioni di sangue e biopsie intestinali, la generazione di librerie PCR per TCR尾 e IGH destinate al sequenziamento di nuova generazione (NGS) e l'esecuzione di analisi dati di base. Consente l'esplorazione della dinamica delle cellule T e B a livello di nucleotidi o di aminoacidi, facilitando l'identificazione di cloni unici in diversi siti anatomici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Genomica
- Sequenziamento di Nuova Generazione
Sfondo
- Il sequenziamento di nuova generazione consente un'analisi dettagliata delle popolazioni di linfociti.
- Questo metodo può rivelare cambiamenti dinamici nelle risposte immunitarie in varie patologie.
- L'identificazione di cloni unici di cellule T o B può portare alla scoperta di nuovi biomarcatori.
- La procedura viene dimostrata da un assistente di ricerca in laboratorio.
Scopo dello studio
- Isolare il DNA da campioni biologici per il sequenziamento.
- Analizzare la diversità delle cellule T e B in diverse malattie.
- Tracciare i cloni di cellule immunitarie in diverse localizzazioni anatomiche.
Metodi Utilizzati
- Isolamento del DNA da campioni di sangue e biopsie intestinali.
- Generazione di librerie PCR per TCR尾 e IGH.
- Esecuzione di sequenziamenti di nuova generazione.
- Analisi dati di base dei risultati del sequenziamento.
Risultati principali
- Isolamento riuscito del DNA da campioni.
- Generazione di librerie adatte per il sequenziamento di nuova generazione (NGS).
- Identificazione di cloni unici di cellule T e B.
- Informazioni sulla diversità dei linfociti in varie patologie.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la comprensione della dinamica immunitaria.
- Fornisce un quadro per l'identificazione di biomarcatori nelle malattie.
- L'approccio può essere adattato per diverse applicazioni di ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi del repertorio immunitario dei recettori delle cellule T e B mediante sequenziamento di nuova generazione fornisce alla ricerca e sviluppo biofarmaceutica una visione ad alta risoluzione della dinamica immunitaria adattativa, consentendo una riduzione del rischio di tipo meccanicistico nella validazione degli obiettivi terapeutici e nella scoperta di biomarcatori. Quantificando clonalità, utilizzo genico e diversità del repertorio in diverse condizioni patologiche, questo metodo sostiene la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta e nei processi decisionali traslazionali. Questa capacità è direttamente applicabile a percorsi di sviluppo focalizzati sull'immunologia, volti a collegare le risposte immunitarie agli esiti terapeutici in condizioni infiammatorie, infettive, oncologiche e autoimmuni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche monitorando cloni di cellule T e B specifici per l'antigene in diversi siti anatomici e punti temporali.
- Valore operativo: Fornisce una risoluzione a livello di nucleotidi o amminoacidi dei repertori immunitari per chiarire l'interazione funzionale con il bersaglio e la riduzione del rischio biologico.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando popolazioni clonalmente espanse che correlano con il fenotipo della malattia o la risposta al trattamento.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili standardizzati e quantitativi del repertorio immunitario, adatti alla standardizzazione dei saggi e alla valutazione della riproducibilità.
- Valore operativo: Consente la preparazione di sistemi biologici validati a partire da sangue e tessuti, per flussi di lavoro di screening successivi.
- Valore tecnico: Produce metriche di clonalità e diversità che fungono da letture affidabili per campagne di screening di composti o prodotti biologici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Mantiene la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica monitorando la dinamica clonale in sistemi pertinenti alla malattia.
- Allineamento dei biomarcatori: Facilita l'identificazione di cloni condivisi o espansi tra pazienti, supportando la scoperta di biomarcatori traslazionali nei disturbi mediati dal sistema immunitario.
- Avanzamento basato sul rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione indicando differenze nell'uso dei geni VDJ e nei modelli di espansione clonale associati alla fisiopatologia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della target fino all'identificazione del lead e agli studi preclinici, in particolare nei percorsi di immunologia e immuno-oncologia in cui la riduzione del rischio associata ai meccanismi immunitari è fondamentale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi rivelando la selezione e l'espansione clonale guidate dall'antigene nei compartimenti delle cellule T e B.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso la preparazione standardizzata e il sequenziamento dei repertori di TCR e IGH a partire da DNA isolato.
- Analisi: Fornisce output quantitativi, inclusi clonalità, utilizzo delle famiglie geniche (V, D, J) e tracciamento dei cloni unici per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica consentendo il monitoraggio longitudinale dei cloni immunitari nei compartimenti ematici e tissutali.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità di piattaforma riutilizzabile, applicabile in diversi ambiti di malattia e tipi di campioni dopo l'adattamento del protocollo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione di bersagli mediati dal sistema immunitario attraverso la misurazione diretta della dinamica del repertorio.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante isolamento del DNA, preparazione di librerie e flussi di lavoro di sequenziamento di nuova generazione (NGS) controllati.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'identificazione precoce di cloni immunologicamente attivi, riducendo i rischi biologici in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio collegando i cambiamenti del repertorio immunitario ai meccanismi della malattia e agli interventi terapeutici.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in immunogenomica, preparazione di librerie per sequenziamento di nuova generazione (NGS) e analisi bioinformatica dei dati del repertorio immunitario.
- È subordinato all'accesso a sequenziatori NGS, sistemi di purificazione basati su microsferette magnetiche e ambienti di laboratorio controllati per la manipolazione del DNA.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro nei settori di immunologia, genomica e scienze dei dati per un'analisi del repertorio coerente.
- Richiede l'adattamento dei protocolli di digestione dei tessuti per organi non intestinali, mantenendo al contempo resa e integrità del DNA.
- I limiti pratici includono i requisiti quantitativi di DNA in ingresso e il potenziale bias introdotto dall'amplificazione PCR durante la preparazione della libreria.
