Coltivare un'epidermide umana ricostruita tridimensionale su larga scala

Il modello di epidermide umana in vitro o costruito è stato sviluppato per la prima volta negli anni Novanta con l'obiettivo primario di sviluppare metodi di sperimentazione alternativi alla sperimentazione animale. Questi modelli epidermici 3D sono ora comunemente usati per testare sia la sicurezza che l'efficacia degli ingredienti cosmetici. Mentre può essere acquistato da diversi fornitori di tessuti, essere in grado di ricostituire un modello 3D in laboratorio offre maggiore flessibilità al punto finale di interesse.

Ci sono diversi articoli di ricerca che descrivono brevemente il protocollo di ricostituzione di un modello epidermico 3D, ma ad oggi non c'era nessun video disponibile che mostrava le fasi critiche del processo di ricostituzione. Questo è il motivo alla base della pubblicazione di questo video paper. La preparazione dell'epidermide umana ricostruita internamente consente molta libertà nel processo di coltura, come cambiamenti nella composizione del mezzo di coltura, fattori scatenanti di stress pro-infiammatorio o ossidativo, silenziamento di geni di interesse e inibizione o stimolazione di alcuni processi biologici.

Per iniziare, scongelare una fiala con 1 milione di cheratinociti epidermici umani normali criocondimenti, o NHEK, in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius immergendo parte del flaconcino in acqua. Incubare il flaconcino per uno o due minuti nel bagno d'acqua, fino a quando non è visibile solo una piccola slitver di ghiaccio. Rimorsi le cellule con molta attenzione con pipettando su e giù da due a tre volte.

Trasferire la sospensione cellulare in due mastri T75 contenenti un totale di 15 millilitri di mezzo di scongelamento pre-avvertito, con conseguente densità di semina di 6,7 per 10 alla quarta cella per centimetro squadrato. Pre-riempire 24 piastre di pozzo con 1,5 millilitri di mezzo sommerso, idealmente utilizzando una pipetta dispenser. Dopo aver coltivato le cellule all'80% di confluenza, sono pronte per la semina in inserti per la coltivazione di epidermide umana ricostruita, o RHEs.

Rimuovere il mezzo basale dai contenitori T75 con gli NHEK. Risciacquare le cellule aggiungendo cinque millilitri di PBS prerifabbrosi a ciascun pallone T75, quindi rimuovere il PBS dai contenitori. Aggiungere da due a tre millilitri di 0,05%Trypsin-EDTA prerifatti a ciascun pallone, assicurandosi che la soluzione di tripina sia equamente distribuita sull'area di coltura cellulare del pallone.

Posizionare i contenitori nell'incubatore di coltura cellulare per quattro minuti, quindi verificare se le cellule si staccano utilizzando il microscopio con un ingrandimento di 10 X. Rapare il pallone per aiutare le cellule a rilasciare dalla superficie del pallone. Una volta staccate tutte le cellule, aggiungere un volume uguale di inibitore della tripside prerimpiri a ogni pallone T75 e trasferire la sospensione cellulare dai contenitori a un tubo di centrifuga.

Risciacquare i contenitori con cinque millilitri di PBS prerifabbro e trasferirlo nel tubo di centrifuga contenente la sospensione cellulare. Centrifugare le cellule raccolte a 400 volte G per cinque minuti. Scartare con cura la maggior parte del supernatante lasciando circa 100-200 microlitri nel tubo.

Sfarfalliare delicatamente il tubo con le dita per allentare con cura il pellet. Rimorsi delicatamente il pellet di cellule in un basso volume di mezzo sommerso, pipettando su e giù da 5 a 10 volte per garantire una sospensione cellulare uniforme. Iniziare con un volume basso per evitare la formazione di aggregati cellulari e aggiungere fino a un millilitro di mezzo sommerso per pallone T75 iniziale.

Contare le celle nella sospensione utilizzando il metodo di esclusione blu trypan. Diluire la sospensione cellulare con ulteriore mezzo sommerso per raggiungere una concentrazione di 3.525 volte 10 alla quinta cella per millilitro, usando la prima equazione fornita nel manoscritto testuale. Eseguire un secondo conteggio delle celle della soluzione diluita e utilizzare la seconda equazione nel manoscritto di testo per calcolare il volume di sospensione cellulare da seminare nell'inserto delle impostazioni cultura.

Appendere i 24 inserti di coltura del pozzo nella posizione più alta della piastra portante e trasferire la piastra portante nella piastra di 24 pozzi preriempito con mezzo sommerso. Aggiungere il volume determinato della sospensione cellulare ad ogni inserto, facendo attenzione a non toccare l'inserto. Dopo la semina, incubare le 24 piastre del pozzo per 10-15 minuti a temperatura ambiente per superare un effetto bordo.

Non spostare le piastre durante questo periodo. Trasferire le piastre nell'incubatore di coltura cellulare e lasciarle in condizioni sommerse per tre giorni. Dopo tre giorni di incubazione nell'incubatore di coltura cellulare, esporre le cellule che hanno aderito alla superficie della membrana all'interfaccia del liquido dell'aria, o ALI, rimuovendo il mezzo sommerso dal compartimento apicale con un sistema di aspirazione e una pipetta Pasteur in vetro.

Riempire nuove piastre da 24 pozzi con 1,5 millilitri di mezzo ALI fresco preri riscaldato e trasferire le piastre portanti con gli inserti di coltura alle nuove piastre multi-pozzo. Trasferire le piastre multi-pozzo nell'incubatore di coltura cellulare. Rinfrescare il mezzo ALI ogni due o tre giorni, per 14 giorni.

I cheratinociti nelle culture 2D mostrano una morfologia tradizionale con una forma poligonale coerente. Dopo 15 giorni all'ALI, l'epidermide umana ricostruita forma un tessuto completamente stratificato, che è indicato dai suoi quattro principali strati epidermici. L'analisi ultrastrutturale dell'epidermide umana ricostruita in diversi punti di tempo nel protocollo di ricostituzione rivela il processo di cornificazione, con un numero maggiore di strati di sito di cornea nel tempo.

I cheratinociti nell'epidermide mostrano diversi profili di espressione proteica in base alla loro fase di differenziazione. L'espressione di Involucrin appare più prevalentemente nel livello SG, mentre l'espressione di filaggrina e loricrina si trova negli strati superiori. L'espressione cheratina-10 è stata trovata in tutti gli strati vitali ad eccezione dello strato SB.

L'epidermide umana ricostruita mostra giunzioni desmosomali funzionali, come indicato dall'espressione di Desmoglein-1 nello spazio intercellulare degli strati epidermici vitali. Le proprietà barriera del modello di epidermide ricostruito sono state studiate valutando la vitalità del tessuto al momento del trattamento topico con un noto disgregatore barriera e valutando l'integrità del tessuto. L'integrità del tessuto è stata determinata dopo 15 giorni misurando il TEER con un voltmetro.

È stata studiata la reattività dell'epidermide al lipopolysaccharide e al fattore di necrosi tumorale alfa. Entrambi i trattamenti alfa LPS e TNF non erano tossici. rispetto al controllo Triton X-100.

Il rilascio di Interleukin-1 alpha e Interleukin-8 nel mezzo RHE è stato quantificato utilizzando la lisi IL. Il trattamento LPS ha portato a un aumento statisticamente significativo della regolazione nel rilascio di Interleukin-1 alpha e Interleukin-8. Il trattamento alfa del TNF ha portato a un aumento statisticamente significativo della regolazione solo nel rilascio di Interleuchina-1 alfa.

Tuttavia, una chiara tendenza all'aumento dei livelli di Interleuchina-8 è stata osservata anche durante la stimolazione con TNF alfa. Seguendo questo protocollo, TEER può essere misurato come valore per l'integrità della barriera. La vitalità o la citotossicità possono essere misurate, ad esempio, da un saggio MTT o LDH.

Il supernatante può essere usato per misurare la secrezione di citochine o altre proteine. Inoltre, il tessuto può essere utilizzato per studiare l'espressione di proteine o geni di interesse.