Polarizzazione delle cellule derivate da monociti umani M1 e M2 e analisi con citometria a flusso sull'infezione da tubercolosi del micobatterio

Questo protocollo offre l'opportunità di seguire la polarizzazione immunitaria di cellule umane derivate da monociti sulla base della visualizzazione e della caratterizzazione approfondita di Mtb marcata con proteina fluorescente verde in diversi sottogruppi di macrofagi utilizzando la citometria a flusso a 10 colori. Questo rappresenta un metodo efficiente e riproducibile per studiare le risposte all'infezione da Mtb nei macrofagi polarizzati M1 o M2, compresa la valutazione del fenotipo e della funzione prima e dopo l'infezione. Per isolare la PBMC dai buffy coat di donatori umani, utilizzare una pipetta per sovrapporre lentamente 15 millilitri di sangue buffy coat lungo il lato di una provetta da 50 millilitri su 15 millilitri di terreno a gradiente di densità e separare le cellule mediante centrifugazione.

Utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere lo strato superiore di plasma e trasferire con cura lo strato di cellule mononucleate in una nuova provetta da 50 millilitri. Aggiungere il terreno RPMI senza siero alle cellule fino a un volume finale di 50 millilitri e capovolgere delicatamente la provetta alcune volte prima di centrifugare. Quindi risospendere le cellule in 20 millilitri di terreno privo di siero per la conta.

Per avviare la differenziazione dei macrofagi, diluire le cellule a una concentrazione di 5 volte 10-6 cellule per millilitro di terreno privo di siero e seminare due millilitri di cellule in pozzetti individuali di una piastra a sei pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per due o tre ore per consentire alle cellule di aderire al fondo del pozzetto. Al termine dell'incubazione, lavare i pozzetti tre volte con un millilitro di terreno privo di siero per lavaggio e aggiungere due millilitri di terreno RPMI completo integrato con 50 nanogrammi per millilitro di GM-CSF o 50 nanogrammi per millilitro di M-CSF per la differenziazione M1 o M2 rispettivamente a ciascun pozzetto di cellule aderenti.

Tre giorni dopo l'inizio della polarizzazione, sostituire con cura un millilitro di surnatante da ciascun pozzetto con un millilitro di terreno completo fresco integrato con i fattori di crescita appropriati. Il sesto giorno di coltura, aggiungere 50 nanogrammi per millilitro di interferone gamma e 10 nanogrammi per millilitro di LPS ai pozzetti trattati con GM-CSF e 20 nanogrammi per millilitro di IL-4 ai pozzetti trattati con M-CSF. Controllare regolarmente la morfologia delle colture cellulari derivate dai monociti mediante microscopia ottica per garantire che i monociti più piccoli si differenzino in cellule più grandi simili ai macrofagi.

Per allestire una coltura di Mtb, in una struttura di biosicurezza di livello III, mescolare un'aliquota da un millilitro di sospensione batterica scongelata con nove millilitri di terreno completo per TB in una provetta con tappo filtrato da 50 millilitri per un'incubazione di 24 ore nella provetta dell'incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, raccogliere i batteri mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 15-20 millilitri di terreno completo per TB fresco in una nuova provetta di coltura con tappo filtrato da 50 millilitri prima di rimettere i batteri nell'incubatore per colture cellulari. Dopo sette-10 giorni di coltura, lavare i batteri due volte in 35-40 millilitri di tampone di lavaggio sterile per lavaggio, risospendendo i batteri in un millilitro di terreno RPMI privo di siero dopo il secondo lavaggio.

Aggiungere altri nove millilitri di terreno RPMI privo di siero ai batteri e sonicare i batteri in un sonicatore a bagno d'acqua in una cabina di biosicurezza di Classe II per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi misurare la densità ottica di un millilitro di sospensione batterica a una lunghezza d'onda di 600 nanometri in uno spettrofotometro posizionato all'interno della cabina di biosicurezza. Per infettare le cellule derivate dai monociti, diluire i batteri a una concentrazione di 5 volte 10 fino alla sesta unità formante colonie per millilitro in terreno privo di siero e sostituire il surnatante in ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare a sei pozzetti con un millilitro di terreno fresco privo di siero e un millilitro di sospensione batterica per pozzetto per ottenere una molteplicità di infezione di cinque.

Dopo un'incubazione di quattro ore nell'incubatore per colture cellulari, lavare ogni pozzetto tre volte con un millilitro di tampone di lavaggio sterile per lavaggio, inclinando accuratamente la piastra per rimuovere l'intero volume di tampone dagli angoli dei pozzetti dopo ogni lavaggio. Quindi risospendere le cellule derivate dai monociti infettate da Mtb in due millilitri di terreno completo senza antibiotici. Per colorare le cellule per la citometria a flusso, incubare le cellule infette con un millilitro di tampone FACS integrato con EDTA 0,5 millimolari per pozzetto per almeno 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule staccate con un pipettaggio delicato e trasferirle in singole provette per microcentrifuga con tappo a vite per la centrifugazione. Risospendere le cellule in circa 50 microlitri di cocktail di anticorpi anti-umani coniugati con fluorocromo e colorante vitale di interesse e incubare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce. Dopo il lavaggio, fissare le cellule con 200 microlitri di tampone di fissazione appena preparato per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.

Dopo la fissazione e il lavaggio, risospendere le cellule in 400 microlitri di tampone FACS e trasferire le cellule in provette da microcentrifuga da un millilitro. Per analizzare le cellule, utilizzare perle di compensazione per compensare il segnale fluorescente per ciascun anticorpo coniugato con fluorocromo nel cocktail e utilizzare cellule non colorate per impostare il cancello per la popolazione cellulare negativa. Quindi acquisire un minimo di 50.000 cellule per campione.

Entrambe le cellule derivate da monociti M1 e M2 mostrano uno spostamento verticale verso una granularità più elevata e una dimensione cellulare ridotta in seguito all'infezione da Mtb. Si osserva anche un'aumentata morte cellulare nelle cellule M1 e M2 infettate da Mtb con una molteplicità di infezioni di cinque rispetto alle cellule M0 non infette. Da notare che un'espressione sostanzialmente più elevata di Mtb GFP si osserva nelle cellule M2 dopo quattro ore di infezione rispetto alle cellule M1.

Le cellule M1 e M2 non infette possono essere caratterizzate rispettivamente dal recettore CD64 e CD86 o CD200 e dalla co-espressione di CD163. Dopo quattro ore dall'infezione da Mtb, si osserva un aumento della frequenza di cellule positive al recettore CD200 nelle cellule polarizzate M1 Mtb GFP positive, mentre l'espressione di CD163 è ridotta nelle cellule M2. I batteri Mtb GFP possono essere osservati anche nelle cellule M1 CD64 positive e nelle cellule M2 CD163 positive mediante microscopia confocale.

L'analisi UMAP rivela che quattro ore di infezione da Mtb non sono sufficienti per influenzare la polarizzazione dei macrofagi, mentre 24 ore di infezione si traducono in cluster chiaramente separati di cellule M1 e M2 non infette e infette che esprimono profili di espressione di marcatori di superficie distinti. Inoltre, l'analisi PhenoGraph mostra che 24 diversi cluster di diverse dimensioni sono distribuiti in modo univoco tra le cellule M1 e M2 non infette e infettate da Mtb. L'efficacia della polarizzazione M1 o M2 o dell'infettività di Mtb può variare sostanzialmente tra i donatori umani.

Pertanto, si raccomanda l'inclusione di almeno due donatori in ogni esperimento per ridurre le variazioni sperimentali. Questo modello consente la valutazione simultanea dei macrofagi umani mediante citometria a flusso, microscopia confocale, analisi dell'espressione dell'mRNA, saggi multiplex di fattori solubili e quantificazione batterica utilizzando l'espressione di GFP o le unità formanti colonie.