Name: 评估流和拉伸下生物材料的炎症和再生能力的多奎生物反应器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习使用多奎生物反应器评估生物材料在剪切应力与循环拉伸下的炎症反应与再生能力。该动态共培养系统利用人巨噬细胞与肌成纤维细胞，为血管组织工程研究提供可控的机械刺激环境。

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本研究由ZonMw资助，属于LSH 2Treat项目（436001003）以及荷兰肾脏基金会（14a2d507）支持的一部分。N.A.K. 感谢欧洲研究理事会（851960）提供的资助。我们衷心感谢由荷兰科学研究组织资助的“材料驱动再生”重力计划（024.003.013）的支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的生物反应器可用于系统评估剪切应力和周期性拉伸对管状可吸收支架中炎症反应和组织再生的单独及联合作用。该方法还可对血管构建物进行多种分析，如代表性结果部分所示。这些结果展示了不同血流动力学加载模式（即剪切与拉伸的不同组合）对组织工程血管构建物生长和重塑的独特影响。通过该体外平台获得的这些见解，有助于优化新型原位组织工程血管支架的设计参数。为确保实验流程的正确进行，理解本方案中的关键步骤及其局限性至关重要。
该实验方案中最关键的步骤与对样品施加拉伸力有关。在施加拉伸力时，确保整个系统无泄漏至关重要。系统中存在两个薄弱环节：一是将静电纺丝移植物固定到压力导管上的结，二是生物反应器底座与流动培养室之间的连接处。如步骤2.5.2和2.5.4所述，必须将多个牢固的结准确地固定在刻蚀凹槽处。如果结不够紧，或位置略高于或低于凹槽，则可能导致液压液轻微渗入流动培养室。这种泄漏可能表现为液压储液罐中的压力下降，以及为达到设定压力值而需要应变泵持续升高电压。此外，这还会导致流动培养室内的流体流动紊乱、细胞培养污染风险增加以及培养基被稀释。一旦发生此类情况，必须将该流动培养室从实验中移除，并使用白...

心血管组织工程（TE）正被探索作为当前使用的心血管永久性假体（例如，血管移植物、心脏瓣膜置换物）的一种替代治疗方案，而现有假体对大量患者群体而言效果并不理想1,2,3,4。备受关注的应用包括组织工程血管移植物（TEVGs）5,6和组织工程心脏瓣膜（TEHVs）7,8。通常，心血管组织工程技术采用可吸收生物材料（天然或合成材料），作为引导新组织形成的支架。新组织的形成可通过两种方式实现：一种是完全在体外进行，即将细胞接种于支架上，并在植入前于生物反应器中培养（体外TE）9,10,11；另一种是在体内原位直接实现，即将合成支架未经预培养直接植入体内，以诱导新组织在体内原位形成（原位TE）12,13,14。无论是体外还是原位心血管组织工程技术，功能性的成功再生主要依赖于宿主对植入物的免疫反应以及适当的生物力学负荷。
生物力学负荷对心血管组织工程的重要性已得到广泛认可15。对于心血管植入物而言，定植于支架上的细胞会受到血流动力学环境所引起的周期性拉伸和剪切应力的作用。已有大量研究报道了（周期性）拉伸对多种细胞类型合成基质成分（如胶原蛋白16,17,18,19、糖胺聚糖（GAGs）20和弹性蛋白21,22）的促进作用。例如，Huang 等人利用血管生物反应器证明，双轴拉伸可促进体外组织工程血管中胶原蛋白和弹性蛋白的沉积与有序排列23。尽管通常强调拉伸作为主要负荷的作用，但这些研究常使用由流动驱动的生物反应器，使样品同时暴露于剪切流中。尽管目前关于剪切应力在三维环境中对组织形成和炎症反应的独立影响尚不明确，但仍有一些相关数据。例如，Hinderer 等人和 Eoh 等人证明，在体外模型系统中，除三维支架微结构外，剪切流对人血管平滑肌细胞形成成熟弹性蛋白也具有重要作用24,25。综上所述，这些研究结果表明，周期性拉伸和剪切应力在心血管组织工程中均具有重要意义。
影响组织工程植入物成功与否的另一个重要因素是宿主对植入移植物的免疫反应26。这一点对于材料驱动的原位组织工程技术尤为重要，因为此类技术实际上依赖于支架引发的急性炎症反应，以启动后续的细胞浸润以及内源性组织形成与重塑过程27。巨噬细胞是功能性组织再生的关键启动者，这一点已得到多项研究的证实28,29,30。类似于伤口愈合过程，组织再生由巨噬细胞与成纤维细胞、肌成纤维细胞等组织生成细胞之间的旁分泌信号通路所调控31,32,33。除了协调新组织的沉积外，巨噬细胞还参与对外源性支架材料的主动吸收34,35。因此，体外巨噬细胞对生物材料的反应已被确定为预测植入物体内成功与否的一个关键参数36,37,38。
巨噬细胞对植入支架的反应取决于支架的设计特征，例如材料组成和微观结构35,39,40。除了支架本身的特性外，巨噬细胞对支架的反应及其与肌成纤维细胞之间的相互作用也受到血流动力学负荷的影响。例如，已有研究表明，在三维电纺支架中，周期性拉伸是调节巨噬细胞表型41,42,43,44以及细胞因子分泌43,44,45,46的重要调节因素。Battiston 等人利用巨噬细胞与血管平滑肌细胞的共培养系统，证明了巨噬细胞的存在可提高弹性蛋白和糖胺聚糖（GAGs）的水平，而中等程度的周期性拉伸（1.07–1.10）可促进I型胶原和弹性蛋白的沉积47。在先前的研究中，我们&#160;已证明剪切应力是单核细胞募集进入三维电纺支架的重要决定因素48,49，且剪切应力与周期性拉伸均会影响人单核细胞与间充质基质细胞之间的旁分泌信号交流50。Fahy 等人证明，剪切流可增加人单核细胞分泌促炎性细胞因子51。
综上所述，上述证据表明，充分理解并控制血流动力学负荷对心血管组织工程至关重要，同时必须考虑炎症反应以实现这一目标。此前已有大量文献报道了用于心血管组织的体外52,53,54,55,56,57,58或离体59,60,61培养的多种生物反应器。然而，这些系统均旨在尽可能模拟生理状态下的血流动力学负荷条件。尽管这对于在体外构建心血管组织或维持离体培养具有重要价值，但此类系统无法对各个独立信号的单独效应进行系统性研究。其原因在于，这些生物反应器中循环拉伸和剪切应力的应用均由同一加压流体驱动，二者本质上相互关联。虽然已有研究报道了可用于2D基底62或3D水凝胶系统63,64的、能够实现精确多信号力学调控的微系统，但这类系统尚不能整合弹性3D生物材料支架。
在此，我们介绍一种管状生物反应器系统的应用，该系统能够独特地实现剪切应力与周期性拉伸的解耦，从而有助于从机制上研究二者各自及联合作用的影响。该系统可用于测试多种组织工程血管移植物（例如，合成或天然来源、不同微观结构、不同孔隙率）。为有效解耦剪切应力与拉伸的施加，该生物反应器所采用的关键设计概念包括：（1）利用独立的泵系统分别控制剪切应力与拉伸；（2）以计算驱动的尺寸参数，采用“由外向内”方式对支架进行刺激。通过流量泵在管状支架的外表面施加流体，而支架的周向拉伸则通过另一个独立的应变泵扩张其固定所用的硅胶管来实现。硅胶管及容纳构建物的玻璃管的尺寸经过精心选择，并通过计算流体动力学模拟进行验证，以确保作用于支架的剪切应力（由流动引起）与周向拉伸（由管体扩张引起）之间不产生显著相互干扰。这种由外向内的设计具有多项实际合理性。若拉伸由管腔内流体压力施加（类似于生理载荷），则&#160;本质上要求样品设计必须无泄漏。此外，拉伸样品所需的压力将完全由样品的刚度决定，而样品间以及同一样品随时间变化的刚度可能存在差异，从而导致拉伸控制困难。该生物反应器将组织工程移植物固定在硅胶管周围，可在移植物外壁施加壁面剪切应力（WSS），并从内部对移植物加压。通过这种方式，可确保样品间及同一样品在时间上的载荷条件一致，同时允许样品存在渗漏，这在多孔血管支架中是常见现象。19这种内翻式生物反应器专门用于系统研究剪切力和/或拉伸力的影响，而非用于体外构建类似天然的血管，后者更适合采用传统的血管生物反应器装置。参见 图1A–B 生物反应器设计图纸及其相应部分 表1 有关生物反应器主要组件的功能描述及其设计原理。
生物反应器的应用基于以下基础&#160;我们课题组近期一系列研究探讨了剪切应力与周期性拉伸对可吸收静电纺支架在原位心血管组织工程中炎症反应及组织形成各自及联合作用19,43,44为此，我们采用人巨噬细胞和肌成纤维细胞，单独培养或共培养，以模拟体内再生级联反应的各个阶段。我们已经&#160;证明了人巨噬细胞的细胞因子分泌受到周期性拉伸和剪切应力的显著影响，进而通过旁分泌信号和直接接触，影响人肌成纤维细胞在这些支架中的基质沉积与排列19,43,44值得注意的是，这些研究发现，在剪切应力与拉伸应变共同作用的情况下，对组织形成和炎症反应的影响要么主要由其中一种载荷主导，要么表现为两种载荷的协同效应。这些结果表明，有必要将这两种载荷解耦，以更深入地理解力学环境对组织工程过程的各自贡献。这种理解可用于在相关血流动力学载荷条件下系统优化支架设计参数。此外，来自此类精确控制环境的力学机制数据可作为数值模型的输入，用于预测原位组织重塑的过程，这在近期关于组织工程血管移植物（TEVGs）的研究中已有报道。65 或TEHVs66，以进一步提高预测能力。

<table><tbody><tr><td>高级杜氏改良伊格尔培养基&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基（aDMEM）</td><td>Gibco</td><td>12491-015</td><td>成纤维细胞培养基</td></tr><tr><td>Aqua Stabil</td><td>Julabo</td><td>8940012</td><td>防止生物反应器-液压储液罐中的微生物生长</td></tr><tr><td>牛纤维蛋白原</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td>制备纤维蛋白原凝胶以在电纺支架上接种细胞</td></tr><tr><td>牛凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td>制备纤维蛋白原凝胶以在电纺支架上接种细胞</td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td>离心收集细胞和条件培养基</td></tr><tr><td>止血钳剪刀 - &quot;凯利钳&quot;</td><td>阿尔梅迪克</td><td>P-422</td><td>夹紧硅胶管，对支架施加预拉伸，以便将支架缝合至刻蚀凹槽中（步骤1和步骤7进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>CO2 细胞培养箱</td><td>三洋</td><td>MCO-170AIC-PE</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>压缩空气储罐</td><td>Festo</td><td>CRVZS-5</td><td>平滑气压波动并为压力积聚创造时间延迟</td></tr><tr><td>自定义 Matlab 脚本用于计算最大拉伸率</td><td>Matlab</td><td>R2017. The Mathworks, Natick, MA</td><td>计算静电纺丝支架的最小和最大外径</td></tr><tr><td>数据采集板</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td>放大器系统与计算机之间的数据处理</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>VWRK4096-9005</td><td>保持无菌工作条件</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Greiner</td><td>758087</td><td>细胞培养基添加剂；血清补充剂</td></tr><tr><td>流动培养室组件，包括带有刻蚀凹槽和小孔的压力导管（用于向硅胶管施加压力）、螺纹、锥形头、带流体入口的上部组件和带流体出口的下部组件、转接衬套</td><td>定制，埃因霍温理工大学生物医学工程系</td><td>n.a.</td><td>流体培养室隔间（步骤1、步骤7中进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>可吸收生物材料在体内直接诱导再生的策略在转化医学中具有重要吸引力。这类材料在植入后会引发炎症反应，进而驱动材料自身的降解以及新生组织的再生。该策略亦被称为原位组织工程，正被用于开发心血管替代物，如组织工程血管移植物。材料支架所受的局部生物力学信号（即拉伸和剪切应力）决定了后续的炎症反应与组织再生过程。本文详细描述了一种自主开发的生物反应器的使用方法，该装置能够独特地实现对管状支架上拉伸与剪切应力的解耦控制。由此可在精确调控的力学载荷条件下，对管状支架的炎症响应与再生能力进行系统性与标准化评估。我们通过人源巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养实验，验证了该方法的应用效果。文中详细讨论了该技术的关键操作步骤，包括生物反应器的构建与调试、支架制备与细胞接种、拉伸与剪切流的施加及维持，以及用于分析的样本采集。</td><td>HE40567002</td><td>对电纺支架（步骤1中已进行高压灭菌）施加真空</td></tr><tr><td>流培培养室的玻璃管</td><td>定制设备 &amp;埃因霍温理工大学先进制造与原型中心</td><td>n.a.</td><td>流体培养室的部件（在步骤1和步骤7中用70%乙醇清洗并保存）</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>细胞培养基氨基酸补充剂，可减少氨的积累</td></tr><tr><td>高速相机</td><td>MotionScope</td><td>M-5</td><td>用于在培养期间监测拉伸；以每秒30帧的频率连续6秒拍摄支架的时间序列图像（即3个拉伸周期）</td></tr><tr><td>高速摄像镜头 - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - 镜头</td><td>尼康</td><td>JAA616AB</td><td>以在培养期间监测拉伸情况；以每秒30帧的频率拍摄支架的时间推移图像，持续6秒（即3个拉伸周期）</td></tr><tr><td>软管夹</td><td>ibidi GmbH</td><td>10821</td><td>阻断培养基流动（在第1步和第7步进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>带有8个螺纹接口的液压储液罐，用于连接8个流动培养室</td><td>定制制造，荷兰埃因霍温理工大学生物医学工程系</td><td>n.a.</td><td>对安装在硅胶上的构建物施加压力（在步骤1和7，用含70%乙醇的纸巾清洁外部，用70%乙醇冲洗储液器，随后用去离子水冲洗）</td></tr><tr><td>Ibidi 泵系统（8套），包括 Ibidi 泵、PumpControl 软件、流体单元、灌注套装（培养基管路）、气压管路、含橙色硅胶珠的干燥瓶</td><td>ibidi GmbH</td><td>10902</td><td>用于控制流体培养室中流速的装置。注意1：ibidi泵经制造商改装，以实现200 mbar的压力容量。注意2：可替换为其他厂商的泵系统，只要能施加相同的流动模式即可。</td></tr><tr><td>手术刀片（10号无菌刀片，单个铝箔包装）和手术刀柄（不锈钢，单独包装）</td><td>Swann Morton</td><td>0301; 0933</td><td>切割硅胶管至支架所需的合适尺寸，并切割缝合材料</td></tr><tr><td>LabVIEW 软件</td><td>National Instruments</td><td>版本 2018</td><td>控制施加于支架的拉伸力</td></tr><tr><td>带有紫外灯的层流生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>302310001</td><td>以确保无菌工作条件。紫外线用于对无法进行高压灭菌或在高压灭菌后可能被接触的物品进行去污染。</td></tr><tr><td>大、小培养皿</td><td>格雷纳</td><td>664-160</td><td>用于无菌工作条件</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸（维生素C）</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>细胞培养基添加剂，对胶原蛋白生成至关重要</td></tr><tr><td>LED 光源冷光源 KL2500</td><td>蔡司</td><td>Schott AG</td><td>以帮助在监测支架拉伸过程中进行延时成像的可视化</td></tr><tr><td>鲁尔接头（雌性和雄性）锁扣与连接器，白色鲁尔帽</td><td>ibidi GmbH</td><td>多种，见（https://ibidi.com/26-flow-accessories）</td><td>用于封闭或连接生物反应器和ibidi泵的部件（在步骤1和步骤7中进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>测量放大器（PICAS）</td><td>PEEKEL instruments B.V.</td><td>n.a.</td><td>用于放大压力传感器的信号并反馈至LabView</td></tr><tr><td>培养基储液器（大容量注射器，60 mL）及储液器支架</td><td>ibidi GmbH</td><td>10974</td><td>培养基储液罐（步骤1和步骤7中进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>外径为4.25 mm、内径为1 mm的中等硬度导管</td><td>Rubber BV</td><td>1805</td><td>以实现更大的流速，使用了直径更大的 ibidi 培养基管路。注意：穿过流体单元阀门的培养基管路部分与默认的 ibidi 培养基管路相同</td></tr><tr><td>Motion Studio 软件</td><td>Idtvision</td><td>2.15.00</td><td>用于获取用于拉伸监测的高速时间序列图像</td></tr><tr><td>针头（19G）</td><td>BD Microlance</td><td>301700</td><td>与细的柔性管路一起使用，用于向液压储液器中注入超纯水而不引入气泡</td></tr><tr><td>持针器</td><td>艾德森</td><td>2429218</td><td>用尼龙缝合线的针穿过硅胶管（在第1步和第7步进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>Kleenex</td><td>38044001</td><td>使用70%乙醇对设备进行清洁</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>若发生泄漏，快速处理方法</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（P/S）</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>细胞培养基添加剂；防止细菌污染</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>用于储存和洗涤步骤（步骤1中进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>带红色螺旋盖的塑料容器（60 mL）</td><td>格雷纳</td><td>206202</td><td>制备纤维蛋白原溶液</td></tr><tr><td>气动缸</td><td>Festo</td><td>AEVC-20-10-I-P</td><td>驱动特氟龙波纹管（在步骤1和步骤7中用含70%乙醇的纸巾清洁）</td></tr><tr><td>聚己内酯双脲（PCL-BU）管状支架（3 mm 内径，200 &amp;micro;m 壁厚，20 mm 长度</td><td>SyMO-Chem，荷兰埃因霍温</td><td>n.a.</td><td>采用15%（w/w）氯仿（Sigma；372978）聚合物溶液通过静电纺丝制备。更多细节参见Van Haaften等，Tissue Engineering Part C（2018）</td></tr><tr><td>无孔压力导管（用于静态对照）</td><td>定制，埃因霍温理工大学生物医学工程系</td><td>未提供</td><td>将静电纺丝管安装到硅胶管上（步骤1和步骤7中进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>压力传感器与换能器</td><td>BD</td><td>TC-XX 和 P 10 EZ</td><td>向气动驱动泵输送的气压逐渐升高，直至达到设定压力</td></tr><tr><td>比例式空气压力控制阀和压力传感器</td><td>Festo</td><td>MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td><td>为气动驱动泵提供压缩空气</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>单核细胞/巨噬细胞培养基</td></tr><tr><td>安全锁式 Eppendorf 管（1.5 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>多种应用（步骤1中进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>20% 十二烷基硫酸钠溶液</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>用于清洁材料，浓度为 0.1%。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硅胶O型环</td><td>Technirub</td><td>1250S</td><td>以防止泄漏（在步骤1、步骤7中进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>硅胶管（2.8 mm 外径，400 μm 管壁厚度）</td><td>橡胶 BV</td><td>1805</td><td>将静电纺丝管安装到压力导管上（在步骤1中进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>无菌管（15 mL）</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td>多种应用</td></tr><tr><td>5-0 Prolene 缝线，带预装锥形针</td><td>Ethicon, Johnson&amp;安普&约翰逊</td><td>EH7404H</td><td>Prolene 缝合线 5-0（75 厘米长，TF 圆锥尖针，1/2 圆弧，针长 13 毫米）</td></tr><tr><td>注射器（24 mL）</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>2057932</td><td>向液压储液器或流动培养室中加入超纯水或培养基</td></tr><tr><td>注射器滤器（0.2 &amp;micro;m)</td><td>Satorius</td><td>17597-K</td><td>过滤纤维蛋白原溶液</td></tr><tr><td>带滤膜瓶盖的T150细胞培养瓶</td><td>Nunc</td><td>178983</td><td>去除培养基中的气体</td></tr><tr><td>带滤膜瓶盖的T75细胞培养瓶</td><td>Nunc</td><td>156499</td><td>用于培养静态对照样本</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯波纹管</td><td>定制生产，埃因霍温理工大学生物医学工程系</td><td>n.a.</td><td>用沾有70%乙醇的纸巾清洁液压储液器外部（步骤1和步骤7）</td></tr><tr><td>托盘（不锈钢）</td><td>PolarWare</td><td>15-248</td><td>便于将流体培养室和生物反应器在培养箱与超净工作台之间转移（使用前后用含70%乙醇的纸巾清洁）</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Wironit</td><td>4910</td><td>各部件的无菌操作（第1步和第7步进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Stakpure</td><td>Omniapure UV 18200002</td><td>为校正培养基蒸发，与水稳定剂混合并用作液压流体。（在步骤1中对超纯水进行高压灭菌）</td></tr><tr><td>紫外光</td><td>Philips</td><td>TUV 30W/G30 T8</td><td>用于接种前移植物和生物反应器部件的去污处理</td></tr></tbody></table>

一种多信号生物反应器，用于在流动和拉伸条件下评估生物材料的炎症反应与再生能力

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

从转化医学的角度来看，使用可吸收生物材料在体内直接诱导再生是一种极具吸引力的策略。这类材料在植入后会引发炎症反应，而该炎症反应正是材料后续被吸收以及新组织再生的驱动因素。这一策略也被称为原位组织工程，目前正被用于开发心血管替代物，例如组织工程血管移植物。炎症反应和再生过程均受到支架局部生物力学信号（即拉伸和剪切应力）的调控。本文详细描述了一种自主开发的生物反应器的使用方法，该反应器能够独特地将管状支架上的拉伸应力与剪切应力解耦。这使得在精确控制的力学载荷条件下，对管状支架的炎症反应能力和再生能力进行系统化、标准化的评估成为可能。我们通过人源巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养实验，展示了该方法的应用。本文详细讨论了该方法中的关键操作步骤，包括生物反应器的构建与设置、支架的制备与细胞接种、拉伸与剪切流的施加及维持，以及用于分析的样本采集。

该生物反应器旨在研究剪切应力和周期性拉伸对三维生物材料支架中血管组织生长和重塑的单独及联合作用。生物反应器的设计可支持在多种加载条件下同时培养多达八个血管构建体（图1A）。血管构建体被置于流动培养室中（图1B），其中环向拉伸和壁面剪切应力（WSS）均可独立控制。流动培养室的上部腔室装有流动整流器，可在相对较短的稳定长度内使流场稳定（图1C）。在流动整流器正下游，导流锥体将流体均匀地分配至环形通道中（图1D）。当实验方案的所有步骤均正确执行时，流动培养室中的血管支架可在支架与玻璃壁之间的环形通道内承受持续单向流动，并由气动泵施加环向拉伸（图1E–F）。在安装支架前，应将静电纺丝管状材料切割为25 mm长的管段（图1G），并可通过扫描电镜（SEM）检测其...

本实验方案的目标是在管状电纺支架中建立人巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养体系，利用可分离剪切应力与周期性拉伸的生物反应器，研究材料驱动的组织再生过程。

使用可吸收生物材料在体内直接诱导再生，从转化医学的角度来看是一种颇具吸引力的策略。此类材料……

迄今为止，确定血流动力学与血管组织再生之间的因果关系一直非常困难，其原因在于难以独立控制各种机械负荷。该生物反应器使我们能够从机制上深入研究剪切应力和周期性拉伸对多种组织工程血管移植物再生潜力的单独及联合作用。本实验操作将由本课题组的博士研究生 Suzanne Koch 和本实验室的博士后研究员 Dr. Tamar Wissing 演示。将静电纺丝支架固定到硅胶管上时，需将一根 4-0 Prolene 缝合线从一段硅胶管的一端穿入，从另一端穿出。在管子两侧各打一个小结，每个结保留约10厘米的线头，然后在两个结上方再打第三个结。移除缝合针后，将硅胶管的边缘修剪成三角形，并在两根10厘米长的线头末端打一个最终结。将静电纺丝支架浸入30%乙醇中，然后将其放置在游离缝合线一端的上方。接下来，由第二位研究人员使用内尖端光滑的镊子，轻轻将静电纺丝支架滑过导管，同时小心拉伸硅胶管的两端以及10厘米长的缝合结。在缓慢释放硅胶管的拉伸张力的同时，用镊子将静电纺丝支架抚平。随后将支架和硅胶管浸入超纯水中两次。组装底部腔室，并确保O形圈正确安装。将一个适配衬套放入底部腔室的上部，然后将带孔的加压导管穿过底部腔室。将硅胶O形圈缠绕在加压导管的下端，以防止泄漏。将底部隔室的下部拧紧到底部隔室的上部，以固定压力导管。确保压力导管的下部刻痕凹槽位于底部隔室适配器套管边缘上方约三至五毫米处。将带有电纺支架的硅胶管拉过压力导管，并在电纺支架的下端、压力导管刻痕凹槽位置处打结并固定缝合金属丝。在对侧再次打结，以将硅胶管与电纺移植物紧密固定。将带有刻度的剪刀夹置于硅胶管的上端，以稳定的方式向上拉动剪刀夹，同时轻轻牵拉电纺支架，以去除任何皱褶。使用缝合丝线在压力导管上端的刻痕凹槽处，于支架两端各打两个结。打好两个结后，松开剪刀夹，并使用刀片切除多余的硅胶管。将鼻锥拧到需要进行动态加载的样品的压力导管螺纹上。将压力导管、管路和支架在30%乙醇中浸润一次，再在超纯水中浸润两次，以预湿装置。将玻璃管套在压力导管上，并轻轻按压底部腔室，以固定玻璃管。然后将流动整直器、硅胶O形圈和接头衬套放入顶部腔室，并将该腔室固定在玻璃管的开口端。在无菌层流柜中操作，从流出端取下雄性引诱剂塞，打开白色引诱剂帽，并在流出端前方放置一块经乙醇浸泡的擦拭纸。通过取下顶部腔室的玻璃管，拆卸流式培养室。将真空移液管置于电纺支架上，尽可能吸除培养基。然后按1:1的比例加入含凝血酶的细胞悬液和纤维蛋白原溶液。轻轻吹打混合液一次，并立即沿支架全长滴加该溶液。当所有细胞接种完成后，缓慢地左右、上下移动支架，以实现细胞的均匀分布。当支架两侧均完成接种后，小心地将玻璃管和上部腔室重新安装，复原灌注培养室。然后将灌注培养室放入培养箱中，使纤维固化。将流动培养室放置在生物反应器底座的八个螺纹之一上，以将生物反应器与泵系统连接。将接头夹安装在培养基管路上。取下覆盖流动培养室上部隔室流体入口的白色螺口帽，并取下培养基管路的雌性螺口接头。将中段管路的一端连接到上部隔室的流体入口，另一端连接到下部隔室的流体出口。将完整的装置从超净工作台转移至培养箱中。将流体单元和生物反应器底座连接至气压管路和电源线。启动软件并初始化泵。依次为各个样品启动培养基流动。然后将应变泵参数调整至所需设置，并开始施加应变。每隔一天监测一次支架所受的拉伸程度。长期培养期间对拉伸和壁面剪切应力的监测表明，这些数值可在长达20天的时间内维持在相对恒定的水平。经过三天的血流动力学负荷后，免疫荧光染色显示单核细胞来源的巨噬细胞和肌成纤维细胞在支架内呈均匀分布。经过20天的共培养，周期性拉伸导致Ⅰ型胶原纤维的数量增多且更粗。而在联合血流动力学负荷组中，周期性拉伸的作用被剪切应力所掩盖，导致Ⅰ型胶原沉积不明显。经过八天的巨噬细胞单培养后，在所有血流动力学负荷条件下均观察到纤维侵蚀和纤维断裂现象，其中静态组的吸收最为显著，而剪切应力组的吸收最不明显。循环拉伸和剪切应力均会影响共培养体系中细胞因子的分泌谱。有趣的是，两种负荷的联合作用表现出其中一种负荷占主导，或两种负荷产生协同效应。共培养实验还表明，机械环境及由此产生的负荷依赖性炎症环境可调节肌成纤维细胞的表型。此外，收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白的基因表达模式与蛋白质合成相关。执行本方案时最重要的是施加拉伸力，此时必须确保装置系统无泄漏。

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