Sviluppo e test di test quantitativi PCR specifici per specie per applicazioni del DNA ambientale

Saggi ben ottimizzati sono fondamentali per la corretta interpretazione dei dati del DNA ambientale. Questo protocollo descrive le fasi di progettazione e test necessarie per sviluppare un tale test. In generale, il DNA ambientale è un metodo non invasivo per rilevare una particolare specie o insieme di specie.

Può ridurre i costi ed essere più sensibile rispetto ai metodi di indagine convenzionali. Questo metodo può aiutare la conservazione e la gestione della fauna selvatica attraverso il rilevamento del DNA di una specie di interesse, consentendo di dedurre potenzialmente la presenza di specie nell'area campionata. A causa della grande sensibilità della PCR quantitativa, la contaminazione può avvenire facilmente e sono necessari controlli negativi per identificare le fasi in cui è stata introdotta la contaminazione.

L'eDNA è un campo disseminato di gergo e termini stenografici. Per coloro che non sono esperti di biologia molecolare o qPCR, le dimostrazioni visive possono aiutare la pianificazione di un disegno sperimentale dalla concettualizzazione alla generazione dei dati. A dimostrare la procedura saranno Dannise Ruiz Ramos, biologa del nostro laboratorio, e Trudi Frost, una studentessa assistente di laboratorio.

Per iniziare, cerca e scarica sequenze da più regioni geniche per le specie di interesse utilizzando il database nucleotidico dell'NCBI. Selezionare tutte le sequenze che corrispondono alle specifiche e selezionare Invia a.Scegliere Completa registrazione, File, Formato download come GenBank o FASTA, quindi Crea file. Queste sequenze sono ora salvate sul computer.

Ripeti questi passaggi per tutte le specie di interesse. Conserva le sequenze per ogni regione del gene in un file separato, poiché verranno analizzate separatamente. Per allineare separatamente le sequenze di ciascuna regione genica, importare i file di sequenza scaricati in un programma di allineamento delle sequenze, come il software Geneious Prime.

Crea cartelle separate per ogni regione del gene, quindi seleziona tutte le sequenze all'interno di una cartella che contiene le sequenze di una regione del gene. Utilizzare lo strumento Allineamento multiplo per creare un allineamento nucleotidico, ad esempio Geneious o MUSCLE delle sequenze selezionate. Scegliete regioni promettenti per la progettazione di saggi attraverso la visualizzazione di dati di sequenza allineati.

Selezionare una regione che abbia a disposizione molti dati di sequenza per le specie di interesse, che sia altamente divergente tra le specie e che mostri una bassa variazione all'interno delle specie. Successivamente, progettare i primer e la sonda del saggio. Utilizza il software di progettazione di saggi qPCR per progettare cinque serie di saggi qPCR.

Incollate la sequenza selezionata nella casella Immissione sequenza. Se l'allineamento ha creato spazi, eliminarli dalla sequenza. Selezionare la sonda qPCR 2 primers nell'opzione Choose Your Design, quindi scaricare i saggi consigliati.

Copiare le sequenze dal primer diretto del primo test e cercare questa sequenza di primer nell'allineamento creato in precedenza. Se si utilizza Geneious Prime, utilizzare lo strumento Annota previsione per aggiungere la regione di base all'allineamento. Fallo per tutte le combinazioni di primer e sonda.

Ispezionare queste regioni dell'allineamento per verificare la presenza di variazioni all'interno delle specie bersaglio, nonché all'interno delle specie concomitanti. Testare i primer in silico attraverso Primer-BLAST di NCBI. Incollare i primer per utilizzare la mia scatola di primer in Parametri di innesco.

Nelle opzioni Parametri di controllo della specificità della coppia di primer, selezionare NR come database e digitare l'ordine tassonomico o la famiglia dell'organismo di interesse nella casella Organismo. Assicurarsi che i primer selezionati non siano in grado di amplificare le specie non bersaglio. Testare l'efficienza del saggio in vitro creando una curva standard e determinare l'efficienza della curva e l'intervallo lineare.

Testare almeno sei diluizioni di dieci volte di uno standard di DNA sintetico contenente la sequenza target, a circa 1-1 milione di copie per reazione. Utilizzare il software qPCR per tracciare il valore CQ di ogni standard sull'asse Y e la base logaritmica 10 della concentrazione standard iniziale in copie per reazione sull'asse X. Il software qPCR dovrebbe eseguire automaticamente una regressione lineare.

Calcola l'efficienza dalla pendenza della regressione. Ispezionare visivamente la curva standard per verificare la presenza di distorsioni o prestazioni scadenti, misurate in base all'efficienza e ai valori R al quadrato. Utilizzare un controllo positivo interno per verificare l'inibizione della PCR dei campioni sul campo effettivi, che può portare a una diminuzione della sensibilità e falsi negativi.

Determinare i limiti di rilevazione e quantificazione per ciascun saggio. Testare i saggi con specie non bersaglio per verificarne la specificità e assicurarsi che il test funzioni bene con un IPC multiplexato. I saggi con una buona sensibilità, specificità ed efficienza possono passare alle fasi successive.

Per eseguire il test in situ del saggio, ottenere più campioni d'acqua ed elaborarli per la qPCR. Esegui il test PCR quantitativo e confronta la concentrazione e la frequenza di rilevamento dell'eDNA con le differenze note del sito in termini di occorrenza e abbondanza. Confermare tutti i rilevamenti mediante sequenziazione.

Le sequenze disponibili di tutte le specie di Unionidae nel fiume Clinch sono state scaricate e allineate. Dopo aver progettato più saggi, sono stati aggiunti cinque set di primer e sonda all'allineamento per la valutazione visiva. I set di primer e sonde sono stati testati in silico e in vitro.

In laboratorio, tutti i saggi sono stati testati utilizzando estrazioni di DNA di 27 specie disponibili per verificarne la specificità. Un test ha amplificato con successo solo le specie bersaglio. Qui viene mostrato un test di successo con una buona efficienza e valori R al quadrato.

Il LOD e il LOQ per il test selezionato erano entrambi di cinque copie per reazione. Al contrario, i saggi che hanno prodotto una curva standard con scarsa efficienza sono stati scartati. In una qPCR di qualità, le diluizioni standard si amplificano a valori di quantificazione del ciclo uniformemente distanziati di circa 3,3 cicli per ogni differenza di concentrazione di dieci volte.

In una qPCR scadente, gli standard possono mostrare variazioni non uniformi nei valori di quantificazione del ciclo tra le diluizioni. L'amplificazione dell'IPC per campioni sconosciuti deve essere confrontata con i risultati dell'IPC di controllo del modello negativo. Se nei campioni non sono presenti inibitori, tutta l'amplificazione IPC dovrebbe avere un raggruppamento stretto nel grafico, con valori di quantificazione del ciclo quasi uguali al controllo senza stampo.

Per i test in situ del saggio, i siti di localizzazione includevano il fondo del letto di cozze nel torrente, il fondo del letto muscolare vicino alla riva, 100 metri a valle del letto nel torrente, 500 metri a valle del letto nel torrente e 500 metri a valle del letto vicino alla riva. I saggi PCR quantitativi per il DNA ambientale possono aiutare nel monitoraggio delle specie invasive e in via di estinzione, oltre a migliorare la nostra comprensione dei cambiamenti spaziali e temporali nel rilevamento delle specie senza dover catturare fisicamente il singolo organismo.