Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale
October 29th, 2020
Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.
Il nostro approccio di rilevamento multiplex basato su cellule immunofluorescenti di DNA, RNA e proteine ci consente di visualizzare simultaneamente proteine e acidi nucleici di diversi tipi e filamenti all'interno di singole cellule. Prima della semina, incubare i vetrini di copertura in etanolo per cinque minuti, seguiti da due lavaggi di due minuti in PBS. Dopo il secondo lavaggio, immergere completamente il vetrino coprioggetto in 20 microgrammi per millilitro di poli-D-lisina per 30 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di matrice in eccesso con due lavaggi in PBS e diluire le cellule di interesse a 1 x 10 alla sesta cellula per 50 microlitri di PBS per concentrazione di vetrino coprioggetti. Quindi seminare 50 microlitri di cellule di interesse su ciascun vetrino coprioggetti rivestito di poli-D-lisina per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare tre volte le cellule in PBS prima di fissarle in paraformaldeide al 4% per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte in PBS prima di permeabilizzare le cellule con 500 microlitri di 0,1% Tween 20 in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare ogni vetrino coprioggetto due volte con 500 microlitri di PBS fresco per lavaggio. Per immobilizzare il vetrino coprioggetti su un vetrino, posizionare una piccola goccia di smalto trasparente su un vetrino sterilizzato e posizionare un bordo del lato privo di celle del vetrino coprioggetti sulla goccia di smalto per unghie e abbassare il vetrino coprioggetti sul lato della cella del vetrino rivolto verso l'alto.
Aggiungere alcune gocce di PBS sul vetrino coprioggetti immobilizzato per evitare che le cellule si disidratino e utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio attorno all'esterno del vetrino coprioggetti. Quando la barriera è stata disegnata, sostituire il PBS con 100 microlitri di proteasi III e posizionare il vetrino in un'incubatrice a 40 gradi Celsius per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini due volte in PBS fresco per due minuti per ogni lavaggio con oscillazione.
Dopo il secondo lavaggio, diluire la sonda di interesse in 200 microlitri di tampone di ibridazione a 67 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri della soluzione della sonda a ciascun vetrino coprioggetti e posizionare i vetrini in un forno umidificato a 40 gradi Celsius per due ore. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio fresco e farli oscillare per due minuti per lavaggio.
Dopo il secondo lavaggio, picchiettare i vetrini per rimuovere il tampone in eccesso e trattare in sequenza i vetrini coprioggetti con una goccia degli amplificatori per i canali fluorescenti 1, 2 e 3 per un'incubazione di 30 minuti e 40 gradi Celsius per amplificatore con due lavaggi di due minuti in un tampone di lavaggio fresco con oscillazione per lavaggio tra i trattamenti. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere una goccia dell'amplificatore fluorescente del canale 4 al vetrino coprioggetti per un'incubazione di 15 minuti nel forno a 40 gradi Celsius e lavare il vetrino due volte con tampone di lavaggio e una volta con PBS come dimostrato. Per l'immunocolorazione delle proteine di interesse, dopo l'ultimo lavaggio, trattare ogni vetrino coprioggetto con 200 microlitri di tampone bloccante per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, decantare il tampone bloccante e aggiungere 200 microlitri dell'anticorpo primario di interesse diluito in PBS più Tween 20 integrato con albumina sierica bovina all'1%. Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente, lavare i vetrini con due lavaggi di 10 minuti in PBS fresco più Tween 20 agitando per lavaggio prima di etichettare i campioni con un anticorpo secondario appropriato per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini due volte con PBS fresco più Tween 20 per 10 minuti agitando per lavaggio.
Dopo il secondo lavaggio, controcolorare i nuclei con un colorante nucleare appropriato per un minuto a temperatura ambiente, seguito da due lavaggi in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Per montare i campioni per l'imaging, posizionare una goccia di soluzione anti-dissolvenza su un nuovo vetrino sterile per campione e stendere la soluzione in modo da coprire un'area delle dimensioni approssimativamente dei vetrini. Staccare i vetrini coprioggetto dalle loro guide e immergere i vetrini coprioggetto nel PBS.
Usa una pinza per rimuovere eventuali residui di smalto e asciuga il retro del vetrino coprioggetti con una salvietta da laboratorio. Quindi posizionare delicatamente ciascun campione di vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso il basso sulla soluzione antisbiadimento e lasciare asciugare i campioni durante la notte. Come prova del concetto di questa procedura, il DNA, l'RNA e la proteina dell'HIV-1 sono stati simultaneamente marcati e visualizzati al microscopio a livello di singola cellula.
In questo esempio, due genomi di DNA dell'HIV-1 possono essere visualizzati all'interno di una singola cellula mentre trascrivono attivamente l'RNA virale. L'RNA virale è stato esportato attraverso il complesso dei pori nucleari e la proteina virale è stata sintetizzata nel citoplasma. Come osservato, si osserva una reattività crociata minima o nulla tra i set di sonde tra i due virus, nonostante la marcatura con due retrovirus con un potenziale di cross-reattività della sonda.
Inoltre, la colorazione dell'RNA virale può essere eliminata se le cellule vengono trattate con RNasi durante la preparazione del campione. È quindi possibile quantificare l'intensità media di fluorescenza integrata del segnale anticorpale per cellula in ciascuna immagine. Come osservato, la quantità di HBV pre-genomica RNA e di HBV RNA totale aumenta nel corso dell'infezione da HBV.
L'imaging dell'infezione da HCV può essere eseguito anche tramite microscopia confocale utilizzando un obiettivo a immersione in olio 60X per rilevare i fluorofori di interesse. Questo approccio altamente specifico consente anche il tracciamento su processi virali o cellulari con un'elevata risoluzione temporale spaziale. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per studiare più virus e altri agenti patogeni.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo di rilevamento immunofluorescente multiplo basato su cellule per la visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine all'interno di singole cellule. L'approccio dimostra la sua efficacia nell'osservare proteine virali e acidi nucleici di diversi tipi e polarità, mostrando la sua ampia applicabilità in vari sistemi biologici.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Biologia cellulare
- Tecniche di immunofluorescenza
- Rilevamento virale
Contesto
- Il rilevamento simultaneo di molteplici biomolecole è fondamentale per comprendere i processi cellulari.
- I metodi tradizionali possono avere difficoltà con la specificità e la reattività incrociata nei sistemi multiplex.
- I progressi nelle tecniche di imaging migliorano la visualizzazione e la quantificazione a livello di singola cellula.
Metodi utilizzati
- Imaging immunofluorescente multiplex
- Analisi di singole cellule in vari contesti virali
- Tecniche di amplificazione e ibridazione fluorescente
Principali risultati
- Etichettatura e visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine dell'HIV-1
- Alta specificità con minima reattività incrociata nei set di sonde
- Analisi quantitativa dell'RNA virale durante l'infezione da HBV
Conclusioni
- Questo studio stabilisce una tecnica robusta per il monitoraggio dei processi virali con elevata risoluzione spaziale e temporale.
- I risultati forniscono preziose intuizioni sui meccanismi patogeni e potenziali bersagli terapeutici in virologia.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Simultaneous visualization of viral nucleic acids and proteins in single cells addresses a critical gap in antiviral target validation by enabling direct observation of replication dynamics. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by correlating nucleic acid expression with protein production across diverse viral systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing spatially resolved, quantitative readouts of viral life-cycle stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking viral nucleic acid transcription to protein synthesis in individual infected cells.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through direct co-localization of DNA, RNA, and protein targets without cross-reactivity between probe sets.
- Scientific Value: Supports functional target validation by visualizing active viral replication stages across HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika, and influenza models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity measurements for viral RNA and protein levels, enabling dose-response assessment in compound screening.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible single-cell readouts compatible with confocal microscopy for high-content applications.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness for antiviral screening by providing simultaneous nucleic acid and protein detection in fixed cells.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks viral RNA accumulation over infection courses, such as HBV pre-genomic RNA increase, to inform pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling.
- Operational Value: Enables high spatiotemporal resolution imaging of viral processes using 60X oil immersion objectives for detailed mechanistic studies.
- Scientific Value: Serves as a template for multiplexed imaging in broader cellular systems, supporting translational continuity from discovery to preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing mechanistic insights post-target identification but prior to lead optimization, particularly for antiviral programs requiring validation of replication inhibitors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing viral nucleic acid export and cytoplasmic protein synthesis in single cells.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed outputs that allow comparison of treatment effects on viral replication and protein expression.
- Analytics: Enables mean integrated fluorescence intensity quantification per cell, facilitating statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling viral RNA and protein dynamics relevant to inhibitor efficacy assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple viral pathogens without reformulation of core probe chemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct observation of viral nucleic acid-protein co-expression, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization via branched DNA ISH technology that improves sensitivity over conventional FISH and accommodates immunostaining compatibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering spatially resolved mechanistic data on viral life-cycle progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on concurrent nucleic acid and protein suppression metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplex immunofluorescence and branched DNA in situ hybridization probe handling.
- Depends on hybridization ovens, confocal microscopes, and hydrophobic barrier pens for slide preparation.
- Necessitates standardization of blocking, antibody incubation, and wash protocols across laboratories for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to new viral targets or cellular systems due to varying nucleic acid accessibility.
- Includes practical limitations such as the need for RNase treatment controls to confirm RNA-specific signal and overnight drying steps for sample mounting.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:24
Cell Seeding, Fixation and Permeabilization
1:40
Coverslip Immobilization and Protease Treatment
2:31
Target Probe and Amplifier Hybridization
3:40
Protein Immunostaining and Nuclear Counterstaining
4:48
Mounting
5:28
Results: Representative Single‐Cell Multiplexed Fluorescence Imaging
6:54
Conclusion
