Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9

Questo protocollo consente ai ricercatori di eliminare con precisione un gene nelle cellule B per studiare gli effetti della perdita di funzione di quel gene o di inserire un gene trans per un'espressione genica trans stabile che può essere utilizzata per scopi di ricerca o terapeutici. Il vantaggio principale di questo metodo è che fornisce una piattaforma universale che consente di ingegnerizzare facilmente e con precisione le cellule B con un'elevata efficienza. Questo metodo può essere utilizzato per ingegnerizzare le cellule B per esprimere anticorpi o enzimi ricombinanti e quindi trasferire tali cellule B per trattare infezioni o nelle enzimopatie.

Per iniziare, scongelare le cellule B in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Durante l'attesa, trasferire due millilitri di FBS preriscaldato in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Una volta che le cellule B sono completamente scongelate, aggiungere immediatamente un millilitro di FBS preriscaldato, goccia a goccia, nel campione.

Incubare a temperatura ambiente per un minuto. Pipettare delicatamente per risospendere il campione e trasferire l'intero volume, goccia a goccia, in una provetta conica contenente due millilitri di FBS preriscaldato. Portare il volume a 15 millilitri con PBS sterile, quindi tappare il tubo e capovolgerlo delicatamente due o tre volte.

Centrifugare il campione a 400 volte G per cinque minuti, quindi scartare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere il pellet con un millilitro di terreno di espansione delle cellule B pre-equilibrato e contare le cellule. Il numero totale di celle dovrebbe essere di circa 10 alla settima cella.

Trasferire le cellule in un pallone contenente 20 millilitri di terreno di espansione delle cellule B pre-equilibrato. La concentrazione finale delle cellule, dovrebbe essere di circa cinque volte 10 alla quinta cellula per millilitro. Incubare il pallone verticalmente in un incubatore per colture tissutali.

Preparare il substrato di trasfezione CRISPR/Cas9 mescolando un microgrammo di sgRNA chimicamente modificato con 1,5 microgrammi di mRNA del nucleo di streptococcus pyogenes Cas9 chimicamente modificato per reazione di trasfezione. Per il controllo, aggiungere un microlitro di tampone TE, invece di sgRNA, in una provetta da 0,2 millilitri di una striscia di otto provette. Accendere un elettroporatore e preparare i reagenti per l'infezione nucleare.

Contare e trasferire 1 milione di cellule B per reazione di trasfezione, in una provetta conica sterile. Portare il volume a 15 millilitri con PBS sterile e centrifugare a 400 volte G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante.

Risospendere le cellule con 10 millilitri di PBS sterile e centrifugare a 400 volte G per cinque minuti, quindi scartare completamente il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere 0,5 microgrammi di mRNA GFP chimicamente modificato per 1 milione di cellule B al pellet cellulare. Risospendere il pellet con 20 microlitri di reagente di trasfezione cellulare primaria per 1 milione di cellule B e mescolare delicatamente pipettando da cinque a sei volte.

Trasferire 20,5 microlitri per reazione di trasfezione nelle provette da 0,2 millilitri contenenti il reagente CRISPR/Cas9. Pipettare su e giù una volta per mescolare e trasferire l'intero volume in una cuvetta di trasfezione. Tappare e picchiettare delicatamente la cuvetta sul banco per assicurarsi che il liquido copra il fondo della cuvetta.

Utilizzare il protocollo delle cellule B primarie umane sull'elettroporatore per la trasfezione. Far riposare le celle elettroporate nella cuvetta a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi trasferire 80 microlitri del mezzo di espansione delle cellule B pre-bilanciato nella reazione di trasfezione nella cuvetta.

Posizionare la cuvetta nell'incubatore per colture tissutali per 30 minuti. Formare delicatamente la testa un paio di volte per miscelare e trasferire l'intero volume del campione dalla cuvetta a un pozzetto appropriato di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti contenente un millilitro di terreno di espansione delle cellule B. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di 1 milione di cellule per millilitro.

Eseguendo un esperimento di knock-in genico, trasferire il vettore virale di tipo sei adeno associato ricombinante a 500.000 di molteplicità di infezione nel pozzetto appropriato contenente cellule elettroporate. Posizionare la piastra in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con umidità. Nell'esperimento knockout, la conta delle cellule B ha mostrato oltre l'80% di cellule vitali con una leggera riduzione del recupero cellulare sia nel campione di controllo che in quello knockout CD19 a 24 ore dall'elettroporazione.

Le cellule B sono state raccolte il quinto giorno dopo la trasfezione per la citometria a flusso e l'analisi delle maree. I grafici a dispersione rappresentativi dei campioni di controllo e knockout hanno mostrato rispettivamente il 14% e il 95% di cellule CD19 negative, dimostrando una significativa riduzione dell'espressione di CD19 nei campioni knockout. I cromatogrammi di sequenziamento genomico hanno mostrato doppi picchi nelle cellule B knockout CD19, indicando inserzioni o delezioni di nucleotidi post-rotture a doppio filamento mediate da CRISPR/Cas9.

L'analisi Indel dei cromatografi dei campioni knockout ha mostrato un'alta percentuale di formazione di indel al locus CD19, che è coerente con la percentuale di perdita di proteina CD19 rilevata dalla citometria a flusso. Le cellule B dell'esperimento knock-in sono state raccolte il giorno 12, dopo l'ingegnerizzazione. I grafici a dispersione hanno mostrato il 64% delle cellule EGFP positive nel campione che ha ricevuto il vettore virale di tipo sei adeno-associato ricombinante, insieme all'RNP, mentre nessuna o minima positività all'EGFP è stata osservata rispettivamente nei campioni di controllo e solo vettore.

Un'amplificazione PCR a giunzione ha mostrato 1,5 ampliconi di coppie di kilobasi nel campione knock-in e nessun prodotto PCR è stato osservato né nel campione di controllo né nel campione di solo vettore. La conta delle cellule ha mostrato che il processo di ingegnerizzazione influisce sul recupero delle cellule nel campione knock-in più rispetto ai campioni di controllo o ai campioni solo vettoriali. Tuttavia, tutti i campioni sono rimbalzati rapidamente entro tre giorni dall'ingegneria.

Questa procedura può essere utilizzata anche per introdurre agenti editor di basi per alterare singole coppie di basi al fine di indurre o correggere mutazioni puntiformi singole nel genoma delle cellule B. Potrebbe anche essere utilizzato per introdurre codoni di stop prematuri o per alterare i siti di splicing, consentendo più knockout genici senza il rischio di traslocazioni cromosomiche. Prima che questa tecnica fosse sviluppata, l'ingegneria delle cellule B umane richiedeva l'uso di altri approcci di ingegneria genetica più impegnativi.

Questa tecnica è un'alternativa più semplice, meno costosa e più veloce. Potrebbe anche essere potenzialmente utilizzato per sintetizzare prodotti di terapia cellulare per uso clinico.