Un test di citometria a flusso basato su DNA / Ki67 per l'analisi del ciclo cellulare di cellule T CD8 antigene-specifiche in topi vaccinati
5 gennaio 2021
L'espansione clonale è una caratteristica chiave della risposta delle cellule T antigene-specifiche. Tuttavia, il ciclo cellulare delle cellule T che rispondono all'antigene è stato scarsamente studiato, in parte a causa di limitazioni tecniche. Descriviamo un metodo citometrico a flusso per analizzare le cellule T CD8 antigene-specifiche in espansione clonale nella milza e nei linfonodi di topi vaccinati.
Il nostro protocollo fornisce un approccio pratico con cui la milza e i linfonodi del topo possono essere utilizzati per riflettere la dinamica della risposta delle cellule T maggiore rispetto a fornire un'istantanea fenotipica allo stato stazionario. La nostra tecnica rileva sensibilmente le cellule T CD8 antigene-specifiche che sono impegnate in una risposta continua. Le cellule T CD8 proliferanti vengono misurate senza i possibili effetti confondenti del trattamento farmacologico in vivo o del trasferimento cellulare.
La nostra tecnica può fornire una finestra sulla dinamica immunitaria in diversi contesti. Ad esempio, in relazione alla risposta alla vaccinazione e alle infezioni, alle malattie autoimmuni e all'immunoterapia del cancro. Preparare un tampone di lavaggio fresco 1x permeabilizzazione diluendo 10x tampone di permeabilizzazione con acqua distillata e filtrarlo attraverso un filtro da 0,45 micrometri per eliminare gli aggregati.
Anticorpo monoclonale diluito Ki67 FITC in tampone di lavaggio a permeabilizzazione 1x come determinato con un esperimento di titolazione per un volume finale di 100 microlitri per campione. Aggiungere 3 millilitri del tampone di lavaggio a permeabilizzazione 1x a ciascun tubo con celle e centrifugare a 400 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
Ancora una volta, aggiungere il tampone di lavaggio a permeabilizzazione 1x e la centrifuga per pellettare le celle. Quindi, scartare il surnatante. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo monoclonale diluito Ki67 FITC al pellet, quindi vortice e incubare per 30 minuti al buio.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 4 millilitri di 1x tampone di permeabilizzazione, centrifugando dopo ogni lavaggio e scartare il surnatante. Aggiungere 350 microlitri di PBS al pellet cellulare per i campioni da acquisire direttamente al citometro a flusso e 250 microlitri di PBS al pellet cellulare per i campioni da incubare con Hoechst per la colorazione del DNA. Preparare la soluzione di Hoechst e PBS e aggiungerla a ciascun campione in modo che la concentrazione finale sia di due microgrammi per millilitro.
Vortice e incubare i campioni per 15 minuti al buio. Quindi, centrifugare i campioni per cinque minuti e aggiungere 350 microlitri di PBS al pellet della cella. Aprire il software e creare diversi gruppi corrispondenti ai diversi organi da analizzare facendo clic su Crea gruppo "nella sezione della barra multifunzione dell'area di lavoro.
Aprire la finestra del gruppo modificato facendo doppio clic sul nome del gruppo e sincronizzare i gruppi appena creati inserendo un segno di spunta sulla funzione sincronizzata. Trascina ogni file FCS nel gruppo corrispondente, quindi crea una strategia di gating che inizia con il gruppo a-LN. Aprire la finestra del grafico facendo doppio clic sul campione completamente macchiato per visualizzare gli eventi non delegati acquisiti per il campione in un dot plot.
Si noti che gli assi x e y sono etichettati come nei file FCS, come indicato nella tabella due del file delle impostazioni del citometro a flusso di questo manoscritto. Verificare che venga visualizzato un numero sufficiente di eventi per una visualizzazione appropriata. Se necessario, aprire le preferenze facendo clic sull'icona a forma di cuore nella barra multifunzione dell'area di lavoro, selezionare Grafici, quindi Dot Plot"come tipo di grafico e verificare che il numero di punti disegnati nella casella corrispondente sia corretto o modificarlo.
Visualizzare gli eventi non delegati nella finestra del grafico in un dot plot con DNA-A sull'asse x e DNA-W sull'asse y. Utilizzate la scala lineare per entrambi gli assi. Se necessario modificare la scala da logaritmica a lineare cliccando sulla casella indicata con una T vicina ad ogni asse nella finestra del grafico.
Selezionate una singola popolazione di celle facendo clic su rettangolo nella sezione dello strumento gating, quindi fate doppio clic al centro del gate rettangolare per visualizzare le singole celle in un dot plot con il parametro FSC-A sull'asse x e lo stampo della cella morta sull'asse y. Fare clic sul poligono per selezionare la popolazione di cellule vive, che sono negative per la morte delle cellule morte. Fate doppio clic al centro del gate poligonale per visualizzare le celle in un dot plot con il parametro FSC-A sull'asse x e il parametro SSC-A sull'asse y.
Fai clic sul rettangolo e crea un cancello rilassato per includere tutte le singole celle vive in quel grafico. Fare doppio clic al centro del cancello rilassato per visualizzare le celle in un dot plot con CD3 sull'asse x e CD8 sull'asse y. Utilizzare la scala di accesso appropriata per la visualizzazione nella finestra del grafico.
Se necessario, modificare la scala x e y facendo clic sulla casella, indicata con una T vicino a ciascun asse, scegliere Personalizza funzione di accesso e modificare decenni neg extra con basi e decenni positivi se necessario. Selezionare le celle CD3+CD8+ facendo clic su poligono. Fate doppio clic al centro del gate CD3+CD8+ per visualizzare le celle in un dot plot con Tetr-gag sull'asse x e Pent-gag sull'asse y.
Selezionare le cellule T CD8 specifiche dell'antigene facendo clic su poligono. Fare doppio clic al centro del gate specifico del gag per visualizzare le celle in un dot plot con DNA-A sull'asse x e Ki67 sull'asse y. Selezionare le celle nelle diverse fasi del ciclo cellulare facendo clic su Quad"nella sezione dello strumento gating della finestra del grafico.
Copiare la strategia di gating creata in un campione nel gruppo corrispondente per applicare i gate a tutti i campioni del gruppo. Quindi copiare le strategie di gating per i gruppi b-milza e CBM, come descritto nel manoscritto del testo. Verificare che tutte le porte siano appropriate per ogni campione dei tre gruppi.
Se necessario, desincronizzare il gruppo e modificare le porte come descritto nel manoscritto. Visualizza le celle BM del cancello rilassato in un dot plot con DNA-A sull'asse x e Ki67 sull'asse y. Visualizza i risultati facendo clic su Editor layout nella sezione della barra multifunzione dell'area di lavoro.
Trascinate ogni gate della strategia di gating nel riquadro di esempio nell'editor di layout e posizionate i grafici in base alla sequenza del gating. Se necessario, modificare il tipo di grafico facendo doppio clic sul grafico corrispondente nel layout e selezionando il tipo appropriato nella finestra di definizione del grafico. Fare clic sul gruppo e iterare per funzioni sulla barra multifunzione del layout per visualizzare i risultati ottenuti in cellule T CD8 antigene-specifiche di ciascun organo e confrontare diversi campioni.
Visualizza i risultati delle cellule del midollo osseo che rappresentano un controllo positivo. Un tipico esempio di analisi del ciclo cellulare delle cellule del midollo osseo è mostrato qui. Il protocollo ha prodotto un basso coefficiente di variazione dei picchi di DNA da G0 a G1 e da G2 a M, indicando un'eccellente qualità della colorazione del DNA.
Una strategia di gating in cinque fasi è stata impiegata per identificare le cellule CD8 specifiche dell'antigene. Due multimeri sono stati utilizzati per migliorare la sensibilità del rilevamento delle cellule T CD8 specifiche del vomito nei topi vaccinati senza aumentare lo sfondo di colorazione nei topi non trattati. Le cellule T CD8 specifiche del vomito nei linfonodi drenanti e nella milza contengono un'alta percentuale di cellule nelle fasi S-G2 / M al terzo giorno post boost.
Inoltre, le cellule T CD8 specifiche del gag nelle fasi S-G2 / M avevano un alto FSC-A e SSC-A quando sovrapposte alle cellule T CD8 totali dello stesso organo. Gli istogrammi offset hanno mostrato che l'espressione di CD62L da parte delle cellule T CD8 specifiche del gag era bassa, come previsto per le cellule T attivate, ad eccezione di alcune cellule in G0 nei linfonodi. Questo metodo è progettato per le cellule T per ottenere un'eccellente qualità della colorazione del DNA insieme alla membrana e alla colorazione Ki67.
L'analisi dei dati della citometria a flusso è un punto chiave. Assicurarsi di utilizzare un controllo appropriato per il posizionamento del cancello. Usando questo metodo, abbiamo scoperto le cellule T nelle fasi S-G2 / M del ciclo cellulare nel mouse e nel sangue periferico umano.
Questa tecnica è stata utile negli studi di immunomonitoraggio nel diabete di tipo 1, nella mononucleosi infettiva e nel COVID-19.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo di citometria a flusso per analizzare linfociti T CD8 specifici per l'antigene in espansione clonale nella milza e nei linfonodi di topi vaccinati. La tecnica consente la rilevazione delle risposte dei linfociti T senza gli effetti confondenti del trattamento farmacologico in vivo o del trasferimento cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Citometria a Flusso
- Biologia dei Linfociti T
Sfondo
- L'espansione clonale è fondamentale per le risposte dei linfociti T specifici per l'antigene.
- Il ciclo cellulare dei linfociti T in risposta è stato poco studiato a causa di difficoltà tecniche.
- Comprendere la dinamica dei linfociti T è essenziale per ottenere informazioni sulle risposte immunitarie.
- Questo studio affronta la necessità di un metodo per analizzare le risposte dei linfociti T in tempo reale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per analizzare le cellule T CD8 specifiche per l'antigene in vivo.
- Fornire informazioni sulla proliferazione delle cellule T durante le risposte immunitarie.
- Facilitare lo studio della dinamica delle cellule T in vari contesti immunologici.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un buffer di lavaggio permealizzante fresco per la colorazione cellulare.
- Uso dell'anticorpo monoclonale Ki67 FITC per rilevare linfociti T in proliferazione.
- Analisi mediante citometria a flusso per valutare le popolazioni di linfociti T e i loro stati di attivazione.
- Strategie di gating per isolare linfociti T CD8 specifici per l'antigene da popolazioni miste.
Risultati principali
- Il metodo rileva con successo le cellule T CD8 specifiche per l'antigene coinvolte in risposte attive.
- La proliferazione delle cellule T CD8 può essere misurata con precisione senza variabili di confondimento.
- La tecnica fornisce informazioni sulle dinamiche delle cellule T durante la vaccinazione e l'infezione.
- I risultati dimostrano l'utilità di questo metodo nello studio delle malattie autoimmuni e dell'immunoterapia del cancro.
Conclusioni
- Il metodo citofluorimetrico sviluppato è efficace per analizzare le risposte delle cellule T.
- Questo approccio migliora la comprensione della dinamica immunitaria in diversi contesti.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per esplorare il comportamento delle cellule T in condizioni fisiologiche e patologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una quantificazione precisa della proliferazione delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene in vivo, affrontando una lacuna fondamentale nel monitoraggio immunologico per lo sviluppo di vaccini e immunoterapie. Distinguendo le fasi G0, G1 e S-G2/M senza ricorrere ad analoghi nucleotidici o alla diluizione di coloranti, fornisce un'istantanea meccanicistica della dinamica dell'espansione clonale. Ciò supporta la validazione degli obiettivi e l'identificazione dei candidati principali collegando l'interazione con l'antigene agli stati proliferativi funzionali nei modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche correlando la specificità per l'antigene con il progresso del ciclo cellulare nei linfociti T rispondenti.
- Valore operativo: Fornisce un risultato riproducibile mediante citometria a flusso per la validazione funzionale del bersaglio, indipendentemente dai limiti associati a BrdU o CFSE.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica quantificando la proporzione di linfociti T specifici per l'antigene impegnati nella mitosi rispetto a quelli in fase G1 o G0.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output standardizzati e quantitativi (DNA-A vs Ki67) adatti allo screening ad alto rendimento di candidati vaccini o immunomodulatori.
- Riproducibilità: Utilizza l'Hoechst 33342 per una discriminazione ad alta risoluzione dei picchi del DNA, garantendo una separazione costante tra G0/G1 e G2/M tra i campioni.
- Scalabilità: Compatibile con l'analisi multiorgano (milza, linfonodi, midollo osseo) e adattabile a specie precliniche per confronti tra studi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Applicabile agli studi sull'efficacia dei vaccini, come dimostrato in topi vaccinati con vettore HIV-gag che mostrano un arricchimento in fase S-G2/M nelle cellule T CD8 specifiche per l'antigene.
- Continuità Traduttiva: Collega la fase di scoperta a quella preclinica fornendo una misura cineticamente risolta dell'espansione delle cellule T predittiva dell'entità della risposta immunitaria.
- Decisioni Adeguate al Rischio: Permette criteri di avanzamento/cessazione basati sulla cinetica proliferativa delle clone specifiche per l'antigene, riducendo la dipendenza esclusiva dai marcatori fenotipici di fine studio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo una valutazione precoce della capacità proliferativa dei linfociti T dopo l'immunizzazione e fornendo informazioni per l'ottimizzazione del composto leader attraverso un profilo immunitario funzionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando il riconoscimento dell'antigene (mediante multimeri del MHC) allo stato del ciclo cellulare, chiarendo se l'interazione induca proliferazione o anergia.
- Screening: Fornisce dati quantitativi pronti per il saggio sulla distribuzione del ciclo cellulare, utili per confrontare piattaforme vaccinali o gli effetti di adiuvanti sull'espansione dei linfociti T.
- Analisi: Genera letture multiparametriche (contenuto di DNA, Ki67, scattering, specificità per l'antigene) che permettono il confronto statistico degli indici proliferativi tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si integra con la validazione preclinica identificando sottopopolazioni di linfociti T attivati e in fase di divisione correlate con l'immunità protettiva nei modelli di infezione e cancro.
- Riutilizzo aziendale: Costituisce una piattaforma riutilizzabile di immunosorveglianza per studi longitudinali nei settori dell'autoimmunità, delle malattie infettive e dell'immuno-oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo risolvendo l'eterogeneità proliferativa all'interno delle popolazioni di linfociti T specifici per l'antigene.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione attraverso una strategia di gating fissa e la colorazione del DNA basata sull'Hoechst, riducendo al minimo la variabilità tra i saggi.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei candidati immunomodulatori in base alla cinetica funzionale dei linfociti T.
- Impatto sul portafoglio: Orienta l'avanzamento corretto per il rischio quantificando la frazione proliferativa dei linfociti T specifici per l'antigene come biomarcatore della qualità della risposta.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in citometria a flusso multicolore, inclusi controlli di compensazione per i segnali FITC-Ki67 e Hoechst.
- Necessita dell'accesso a un citofluorimetro in grado di fornire eccitazione UV per la rilevazione di Hoechst 33342 e dotato di appositi set di filtri.
- Richiede protocolli standardizzati di permeabilizzazione e lavaggio per preservare l'integrità dell'epitopo per Ki67, multimeri e marcatori di superficie.
- Comporta l'ottimizzazione della concentrazione di Hoechst (2 µg/mL) e del tempo di incubazione per evitare citotossicità pur ottenendo una risoluzione ottimale dei picchi del DNA.
- Dipende da una gerarchia di gating corretta, che inizia con l'esclusione di singoletti e cellule vitali, per garantire un'identificazione accurata delle cellule T specifiche per l'antigene.
